Bachelor and Master Theses

Das Ziel der Arbeit zu dem Thema "Machbarkeitsstudie zur Erstellung eines genetischen Baukastens zur kombinatorischen Synthese einer bakteriellen Promotorregion" bestand darin, die prinzipielle Funktion des Konzeptes GEMOCO (Gene module combinatorics) zu untersuchen und die ersten Methoden dafür zu erstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Promotorregion des Plasmid pGFP mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten. Das herausgeschnittene Insert-Fragment konnte mit einem via GEMOCO hergestellten Insert erfolgreich ersetzt werden. Weiterhin wurde eine kleine Genbibliotek mittels eines Markov-Models erzeugt. Die Optimierung der GEMOCO Methode beinhaltete die Testung von Einflüssen von Reaktionspuffern, Herstellungsmethoden der DNA Module, Trennverfahren und Konzentrationsverhältnisse der DNA.

Im Rahmen dieser Bachelorarbeit wurde die Anwendung von stickstoffdotierten Kohlenstoffnanoröhrenelektroden (N-MWCNTs) sowie deren Modifikation mit Goldnanopartikeln (N-MWCNTs/AuNPs) zur Analyse von Dopamin einzeln und in Anwesenheit von Ascorbin- und Harnsäuren untersucht. Die Experimente wurden in Schweineblutserum, rein oder mit phosphatgepufferter Salzlösung versetzt, durchgeführt. Mithilfe elektrochemischer Untersuchungsmethoden, wie cyclische Voltammetrie und Square-Wave-Voltammetrie, konnten Erkenntnisse über die Empfindlichkeit beider Elektrodenarten, in einem bisher für diese Anwendung nicht untersuchten Medium, gewonnen werden. Die mit Goldnanopartikeln modifizierten Elektroden zeigten stets höhere Sensitivitäten gegenüber Dopamin, als die nicht modifizierten Analoga.

Biomaterialien werden zunehmend im medizinischen Bereich eingesetzt. Die Entwicklung neuer, optimierter Biomaterialien ist daher sehr wichtig. Oberflächeneigenschaften, Steifigkeit und Struktur des Biomaterials spielen eine wichtige Rolle bei der Adhäsion, dem Wachstum, der Proliferation und der Differenzierung der Zellen. Durch Ändern der Oberflächeneigenschaften, z.B. Die Steifigkeit und die Struktur, kann dieser Effekt erhöht oder verringert werden. In dieser Arbeit wurde die Biokompatibilität eines Materials (LCM) in verschiedenen Formen (Rund- und Gerüstbau) und mit unterschiedlichen Oberflächenmodifikationen durchgeführt. Die Oberflächeneigenschaften wurden durch die Benetzbarkeit und Oberflächenladung sowie die Bestimmung der Steifigkeit durch die Lockerung eines Feststoffs charakterisiert. Die Untersuchung der physikochemischen Einflüsse von Biomaterialien auf das Zellverhalten wurde durch mehrere Verfahren durchgeführt, z.B. Zellzahlbestimmung, Mikroskopie (CLSM) und qualitative Kollagen- und Kalziumbestimmung. Diese Methoden wurden verwendet, um das Wachstum, die Adhäsion und die Differenzierung von Stammzellen (o-MSCs) zu untersuchen. Der Einfluss des Materials zeigte deutlich, dass steifer Material für die Ausbreitung der o-MSC gut war. Die Oberflächenladungen zwischen Material und Kollagen unterscheiden sich kaum, aber der Grund für diesen Effekt ist nicht bekannt. Es wurde durch die Zellzahlbestimmung gezeigt, dass eine Kollagenbeschichtung die beste Oberflächenmodifikation des LCM3-Materials war. Die Kollagenbeschichtung hatte den Einfluss des Materials kompensiert und die Wachstumsrate der o-MSC erhöht. Es konnte auch gezeigt werden, dass die 3D-Struktur des Materials einen ähnlichen Einfluss auf das Zellverhalten hatte. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass Gerüste und Kollagen in vitro für o-MSC gut geeignet sind. Diese Schlussfolgerung könnte auch durch die visualisierten Bilder (CLSM) bestätigt werden. Darüber hinaus wurden Untersuchungen zur Zelldifferenzierung durchgeführt. Der Einfluss von Beschichtung und Steifigkeit auf die Genexpression von Zellen variierte in den verschiedenen Strukturen. In der 2D-Struktur beeinflusste die Kollagenbeschichtung die Zelldifferenzierung nicht und das weiche Material verlangsamte die Zelldifferenzierung. Bei der Kultivierung in der 3D-Struktur unterstützten sowohl die Kollagenbeschichtung als auch das weiche Material die Differenzierung. Die Zelldifferenzierung in Kombination mit der Zellproliferation zeigte, dass 3D-Gerüste sowie eine Kollagenbeschichtung optimale Bedingungen für das Zellverhalten zeigten. Für eine statistische Sicherung der in den Genexpressionsstudien gefundenen Trends sind weitere Untersuchungen mit wesentlich höheren Probenzahlen erforderlich. Eine weitere wünschenswerte Studie ist die quantitative Analyse der Kalzium- und Kollagenproduktion. Die Methoden, die in dieser Arbeit verwendet wurden, waren nur für eine qualitative Bewertung geeignet, für die quantitative Analyse waren die Mengen an mineralisiertem Calcium und Kollagen zu niedrig. Die dynamische Kultivierung, die ähnliche Bedingungen wie in der biomimetischen Umgebung von Zellen hat, könnte in der künftigen Arbeit durchgeführt werden. Da die 3D-Struktur analog zu natürlichem Gewebe ist, haben Designer-Gerüste ein hohes Potenzial für die Etablierung im Tissue Engineering, z.B. Um ein beschädigtes Gewebe- oder Gewebedefekt ohne Spenderorgane zu ersetzen oder zu regenerieren. In dieser Arbeit wurden knochenzellfreundliche Materialien (LCM) verwendet. Sie eignen sich hervorragend für Knochengewebetechnik. Gerüste sind auch kostspielig und zeitaufwändig wegen ihres schwierigen Herstellungsprozesses. Die 2D-Struktur hat daher auch ihre Vorteile. Die Messung der Wechselwirkung zwischen Zellen und Materialien ist sinnvoll in der 2D-Struktur zu bestimmen, da der Zellkontakt mit Materialien sehr groß ist. Wenn die Materialien Drogen enthalten, könnte das Medikament die Zielzellen effektiv beeinflussen. LCM-Gerüste können speziell für die entsprechenden Anwendungen und Bedingungen im Tissue Engineering mit der 2PP-Technologie und der präsentierten LCM-Plattform entwickelt werden. TPMS sorgen für ein hohes Flächen-zu-Volumen-Verhältnis und keine Totvolumina. Im Vergleich zu anderen Anwendungen ist das LCM3-Gerüst ideal für die Zellproliferation. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die These, dass LCMs für den Einsatz im Tissue Engineering sehr geeignet sind, bestätigt werden kann. Gerüste können im Körper (in vivo Tissue Engineering) sowie im Labor (in vitro Tissue Engineering) aufgrund ihrer 3D-Struktur erfolgreich eingesetzt werden.

Die Masterarbeit befasst sich mit dem Einsatz der Mikrofluidik für organisch-chemische Synthesen. Es wurde im besonderen Maße auf eine nachhaltige Produktbildung Wert gelegt ("Green Chemistry"). Dies beinhaltete den Einsatz möglichst geringer Lösungsmittel- und Eduktmengen, sowie die Nutzung vorwiegend wässriger Komponenten während der Synthese. Zwei der drei Synthesen waren "Bulk"-Chemikalien, also Stoffe, deren Einsatzmöglichkeiten den pharmazeutischen, kosmetischen oder Agrochemikalienbereich abdecken. Der Hintergrund der Synthese eines Azofarbstoffes lag in dessen besonderer Eigenschaft der cis-trans-Isomerie begründet. Durch diese ist es möglich, die Konfiguration und die Eigenschaften des Moleküls zu ändern, so dass es als photoschaltbares Oberflächenmolekül die Benetzungseigenschaften auf Oberflächen in Anwesenheit von UV- oder sichtbarem Licht zu ändern vermag. Für diese Synthese wurden neben den herkömmlichen analytischen Methoden (HPLC, GC-MS) auch zwei speziell für die mikrofluidischen Module integrierte "On-Line" Detektionsplattformen verwendet, die photometrische und mikrowellensensorische Methoden beinhalteten. Es konnte gezeigt werden, dass bei der Synthese des Styrolderivats 1,2-Dichlorethylbenzol aus Styrol mit dem Oxidationsmittel Oxone® (KHSO5 &hahog; KHSO4 &hahog; K2SO4) und NaCl bzw. NH4Cl als Chlorquelle (wässrige Phase) die mikrofluidische Plattform gegenüber der Batch-Synthese, bei bestimmten Synthesebedingungen höhere Produktumsatzraten erzielte. Solche Phasentransferreaktionen, bei der eine Reaktionskomponente von einer in eine andere Phase durch Diffusion überführt wird, lässt sich auch sehr gut auf die Synthese von Azofarbstoffen übertragen. Der zweistufige Synthesemechanismus beruht auf der Mills-Reaktion, bei der zunächst durch die Oxidation eine aromatische Amino- in eine Nitroso-Komponente überführt wird. Anschließend erfolgt eine Kondensationsreaktion zwischen dem Nitroso-Aromat und einem Anilin zum entsprechenden Azofarbstoff. Zur Analyse der jeweiligen Produkte standen sowohl ein HPLC als auch ein Standard UV-VIS-Spektrometer zur Verfügung. Ergänzt wurden die Methoden durch externe GC-MS Messungen und einer im Institut für Bioprozess- und Analysemesstechnik (iba e.V. Heiligenstadt) entwickelten mikrofluidischen Photometerkammer für Absorptionsmessungen im UV-VIS- Bereich. Ein weiterer Bestandteil der Arbeit umfasste erste Voruntersuchungen für eine chemo-enzymatische Synthese. Diese bezogen sich auf das Verhalten des Enzyms der Alkohol Dehydrogenase aus dem Organismus Lactobacillus Kefir (LK-ADH) in verschiedenen Lösungsmitteln (Rapsöl, Butylacetat, Ethylacetat und Methyl-tert-butylether), die für die Synthese eingesetzt werden sollten. Letztendlich konnten zwei der Lösungsmittel (Butylacetat und Ethylacetat) für die Synthese verwendet werden und zeigten erste positive Ergebnisse.

Biofilme spielen im Leben des Menschen eine entscheidende Rolle, da sie häufig eine gesundheitliche Gefährdung für den Menschen darstellen. Da die Biofilmbildung innerhalb von Stunden geschieht und deren Beseitigung später schwierig ist, soll die Adhäsion der Bakterien schnellstmöglich detektiert werden. Im Zuge dieser Arbeit wurde die Biofilmbildung mittels kontinuierlichem, nichtinvasivem impedimetrischem Monitoring aufgezeichnet und beobachtet. Um unterschiedliche Oberflächeneigenschaften zu erzielen, wurden diese mit drei verschiedenen Beschichtungen (PEI, PDADMAC, ConA) chemisch modifiziert. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass die physiochemische Veränderung der Oberfläche deutliche Auswirkungen auf die Biofilmdicke und den Besiedlungsgrad der jeweiligen Oberfläche hatte. Mittels Impedanzversuche konnte detektiert werden, dass die Biofilmbildung auf PDADMAC-beschichteten Elektroden am optimalsten war und die Biofilmdicke mit der Zeit zunahm. Auch konnte aufgrund der Impedanzspektroskopie gezeigt werden, dass PEI eine bakterizide Wirkung auf Bakterien hatte und eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Biofilmen ermöglichte. Auf Grundlage von optischen Methoden, CLSM- und Weißlichtinterferometermessungen, war dies nicht möglich. Die Biofilmdicke wurde zusätzlich mit Hilfe des Weißlichtinterferometers und dem CLSM aufgenommen. Anschließend wurden die Messungen ins Verhältnis zu der jeweiligen relativen Änderung |Z| gesetzt. Hierdurch konnte eine Korrelation zwischen dem Ansteigen und Abfallen der Impedanzwerte und der Biofilmdicke nachgewiesen werden. Bei der Nutzung von PDAMAC sowie ConA wurde bei CLSM- und Weißlichtinterferometeraufnahmen ein höherer Besiedlungsgrad festgestellt als bei der Nutzung von PEI. Auch wurde bei den CLSM-Aufnahmen die bakterizide Wirkung von PEI bei direktem Kontakt mit den Bakterien ersichtlich. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit die Zugabe von Antibiotikum Auswirkungen auf einen bereits bestehenden Biofilm und einen sich bildenden Biofilm hatte. Sowohl impedimetrisch als auch bei CLSM- und Weißlichtinterferometermessungen konnte detektiert werden, dass die Biofilmentstehung dadurch nur gehemmt stattfand. Auch konnte der Einfluss von Antibiotika auf einen bereits bestehenden Biofilm gezeigt werden, da sich die Biofilmdicke und der Bedeckungsgrad reduzierten.