Studienabschlussarbeiten des Fachgebiets

In dem ersten Teil dieser Masterarbeit wurde eine Methode für die Herstellung von Liposomen, die aus Cholesterol, PEG-2000 und DSPC bestehen, entwickelt. Um die Methode zu etablieren und die beste Partikelgrößenverteilung mit der kleinsten Standardabweichung und der größten Anzahl an Liposomen zu erzeugen, wurden verschiedene Parameter wie zum Beispiel Mischungsart, -zeit, und -temperatur optimiert. Die besten Ergebnisse wurden mit Ultraschall mit einer Mischungsart von 120 min bei einer Temperatur zwischen 60 und 70 ˚C erzielt. Die Methode produziert reproduzierbare LNPs mit einem mittleren Radius von 2,2 μm und einer Standardabweichung von 0,1 μm. Die Charakterisierung der Lösungen wurde mittels Lichtmikroskopie und einer statistischen Auswertung der erhaltenen Bilder mithilfe der Software FIJI durchgeführt. Die optimierte Methode wurde verwendet, um T7-DNA als Testsystem für ein therapeutisches Mittel einzukapseln. Dafür wurde Lipofectamine 3000® als katonisches Lipid verwendet, das die Verkapselung der T7-DNA fördert. Um die Verkapselungsfähigkeit auswerten zu können, wurde eine Färbung des T7-Genoms mit PI durchgeführt und durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Verkapselung wurde mit der Beobachtung von fluoreszierenden Liposomclustern überprüft, wobei die kugelförmigen LNPs unterscheidbar sind. Zur Reinigung dieser Liposomenlösung wurde eine Methode entwickelt, die auf Zentrifugation und Redispergierung in TE-Puffer basiert. Eine optimale Reinigung der Lösung wurde mit einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 4000 RPM (1789 G-Force) für 5 Minuten bei 4 ˚C und 6 edispergierungsschritten in Puffer erreicht, ohne die Stabilität oder morphologischen Eigenschaften der Liposomen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde als Ergebnis dieses Prozesses eine homogene Lösung erhalten. Auf der anderen Seite wurde die Schutzfähigkeit der LNPs in Bezug auf die T7-DNA anhand der Verwendung einer Endonuklease (DNase I) bewertet. Die Stabilität der Liposomen wurde durch Fluoreszenzbilder und Lichtmikroskopie untersucht, die Ergebnisse zeigen, dass die Liposomen die Fähigkeit haben, das T7-Gemon vor dem Nukleaseverdau zu schützen. Zum Schluss wurde die Infektionsfähigkeit der Liposomen mit eingekapselter T7-DNA durch einen in vitro Test an einer Zellkultur der Linie HEP-G2 ausgewertet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Vergleich einer Negativkontrolle mit einer Dreifachprobe sowohl durch Fluoreszenzmikroskopie mit Färbung als auch anhand des Cell Counter CASY®untersucht. Liposomen bewirken eine Verringerung des Anteils der lebensfähigen Zellen um 24,7 %, was durch Fluoreszenzmikroskopiebilder bestätigt wurde. Aus den in dieser Masterarbeit gewonnenen Erkenntnissen kann im Wesentlichen geschlossen werden, dass die entwickelte Methode die Herstellung stabiler Liposomen mit der Fähigkeit, DNA aus dem T7-Bakteriophagen einzukapseln, zu schützen und in eine eukaryotischen Zelle der Hep-G2-Zelllinie zu transportieren und zu infizieren, gelungen ist.

Pflanzenschutzmittel sind in der heutigen Zeit unumgänglich. Hierbei wird täglich nach neuen Mitteln gesucht, um Pathogene effektiv bekämpfen zu können ohne die Pflanzen zu schädigen. Dabei zeigten sich besonders die cyclischen Lipopeptide als vielversprechend. Ein Vertreter dieser Klasse ist das Keanumycin A, welches vom Bakterium Pseudomonas fluorescens produziert wird. Das Keanumycin A zeigt eine sehr starke antimykotische Wirkung. Somit eignet es sich gut für die landwirtschaftliche Anwendung. In dieser Bachelorarbeit wurde die Keanumycinproduktion unter Variation des Mediums, sowie der Verfahrenstechnik untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass eine Erhöhung der Kohlenstoffquelle sich positiv auf die Keanumycinproduktion ausübt. Bei erhöhter Kohlenstoffquelle im Batch-Ansatz konnte eine Steigerung von 254 % (3,23 mg/l) erreicht werden. Bei Verwendung eines Fed-Batch-Prozesses wurde eine Maximalkonzentration von 5,32 mg/l (419 %) erreicht. Schlagwörter: Antimykotisch, Cyclische Lipopeptide, Pseudomonas fluorescens, Keanumycin, Pflanzenschutzmittel

Das chemische Recycling von Polycarbonat (PC) und die Herstellung neuer reaktiver Furane als DASA-Vorläufer stellen einen vielversprechenden Ansatz zur Bekämpfung der Kunststoffverschmutzung dar. Diese innovative Methode ermöglicht die Isolierung und Charakterisierung neuer DASA-Vorläuferstoffe und eröffnet Möglichkeiten für deren weitere Entwicklung und Erforschung. Die potenziellen Anwendungen dieser neuen reaktiven Furane sind umfangreich und vielfältig. Eine spannende Perspektive ist die Fähigkeit, Biomoleküle zu verbinden oder neue funktionelle Gruppen durch Click-Reaktionen einzuführen. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuartiger Materialien und Oberflächenmodifikationen. Insbesondere können die reaktiven Furane an Polycarbonat-Oberflächen gebunden werden, die mit verzweigtem Polyethylenimin (BPEI) funktionalisiert sind, um DASA-basierte Beschichtungen zu schaffen. Die Strukturiertheit und Belastbarkeit dieser Beschichtungen kann durch photolithographische Techniken gemessen werden. Außerdem können die Benetzungseigenschaften der Oberflächen durch Photoreaktionen verändert werden, was zusätzliche Kontrolle und Vielseitigkeit bietet. Eine wichtige potenzielle Anwendung dieser Studie ist die Kontrolle und Strukturierung der Zelladhäsion auf diesen DASA-beschichteten Oberflächen durch Licht. Azidoglukosekonjugate können verwendet werden, um Zellen an die Oberflächen zu binden, was eine präzise Manipulation und Strukturierung der Zelladhäsion ermöglicht. Darüber hinaus können auch andere Biomoleküle mit Hilfe der DASA-Chemie auf den PC-Oberflächen immobilisiert werden, wie in dieser Forschung beschrieben. Insgesamt eröffnet diese Studie neue Möglichkeiten für die Entwicklung von funktionellen Materialien, Oberflächenmodifikationen und die Kontrolle der Zelladhäsion mit DASA-basierten Systemen. Die genauen Funktionen und Anwendungen der neu synthetisierten reaktiven Furane müssen noch vollständig erforscht werden, was spannende Möglichkeiten für die zukünftige Forschung und Entwicklung auf dem Gebiet der Materialwissenschaften und des Bioengineering bietet.

Die gezielte Verabreichung von Arzneimitteln in der Krebstherapie ist eine wirksame Strategie zur selektiven Bekämpfung von Tumorgewebe. Ein vielversprechender Ansatz in der modernen Krebsimmuntherapie ist die gezielte Ansprache spezifischer Tumormembranproteine für die Verabreichung von Antikörper-Konjugaten zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken. Für die Entwicklung von hochaffinen und spezifischen Antikörpern sind effiziente Hochdurchsatz-Screening-Verfahren von großer Bedeutung. Phage Display in Kombination mit einer synthetischen Bibliothek ist eine schnelle und leistungsfähige Technik zur Auswahl von Antikörpern, die auf der genetischen Manipulation von filamentösen Bakteriophagen beruht. In der vorliegenden Arbeit wurde das etablierte Hit-Identifikationsverfahren angewandt, um neue VHH Single-Domain-Antikörper zu identifizieren, die aus einer hochdiversen synthetischen Bibliothek gegen ein definiertes Zielprotein in der Transmembranregion bestimmter Tumorzellen stammen. Des Weiteren wurde getestet, ob eine Hitze-Inkubation der Phagen vor dem Bio-Panning die Trefferzahlen beeinflusst. Das angewandte Screening führte zur Identifizierung neuartiger VHH Single-Domain-Antikörper, von denen einige eine Kreuzreaktivität zwischen Mensch und Maus aufweisen. Die Hitzeinkubation erwies sich bei diesem Screening als vorteilhaft. Eine Charakterisierung der identifizierten VHH's wird durchgeführt werden. Auf der Grundlage dieser Daten werden die VHH's für eine Anwendung in verschiedenen Projekten bewertet.

Im Laufe der Zeit kann sich eine Population von Individuen genotypisch und phänotypisch verändern. Anhand der Evolution von einer Viren- bzw. Phagenpopulation kann man untersuchen, wie sich die Individuen verhalten. Im Gegensatz zu RNA-Viren wurden DNA-Viren diesbezüglich bis jetzt nur wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit wird die Evolution von dem nicht human-pathogenen DNA-Bakteriophagen T7 untersucht. Bereits in einigen vorhergehenden Masterarbeiten wurde gezeigt, dass sich die Fitness von T7 im Laufe der Passagen verändert, abhängig davon, ob man zur Vermehrung die Plaque-to-Plaque-Methode oder large-scale Passagen einsetzt. Dies lässt sich anhand der Theorien von Muller’s Ratchet und von der Red Queen-Hypothese (RQH) erklären. Diese Arbeit sollte als eine Erweiterung der Untersuchung der Evolution des Bakteriophagen T7 dienen. Hierfür wird sein Genom mit Hilfe von Amplifikationsmethoden (PCR) und eine nachfolgende Analyse mittels Restriktionsverdau untersucht.

Auf Grund seiner psychoaktiven Wirkung ist Psilocybin, der Inhaltsstoff vieler halluzinogener Pilze, interessant zur Behandlung verschiedenster neurologischer Erkrankungen wie Angststörungen, Süchten und Depressionen (Nichols, 2020). Die biotechnologische Herstellung von Psilocybin in Aspergillus nidulans (Hoefgen et al., 2018) ist in diesem Kontext eine Alternative zur chemischen Synthese (Kargbo et al., 2020). Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Prozessoptimierung zur Herstellung von Psilocybin in A. nidulans im Schüttelkolbenmaßstab mit anschließend Scale-up in den 7 l-Bioreaktormaßstab durchgeführt. Im Schüttelkolbenmaßstab konnten in dem Aspergillus Minimalmedium nach Barratt et al. (Barratt et al., 1965), gepuffert auf pH 7,0 mit 100 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, die höchsten Produktkonzentrationen erzielt werden. Bei der detaillierten Untersuchung der Kultivierung konnte eine Stickstofflimitation sowie ein Biomassemaximum nach 48 h Kultivierung festgestellt werden. Die maximale Produktkonzentration konnte nach 172 h mit Beendigung der Kultivierung gemessen werden. Unter sauerstoffunlimitierten Bedingungen konnte mit dem optimierten Induktionszeitpunkt kurz nach dem Maximum der Sauerstofftransferrate, hier nach 30 h, ein Maximum von 243 mg/l Psilocybin nach bereits 72 h Kultivierung gemessen werden. Durch die Zugabe von Tryptophan als precursor konnte die Psilocybinkonzentration auf 262 mg/l gesteigert werden. Mit dem Scale-up der optimierten Kultivierung in den 7 l Bioreaktor wurde die prozesstechnische Realisierbarkeit gezeigt. Jedoch wurden nur 85 mg/l Psilocybin gebildet, was z. B. am Alter der für die Vorkultur verwendeten Sporen gelegen haben kann und die Grundlage für eine weitere Optimierung darstellt. Insgesamt ist es dieser Arbeit gelungen, das Kultivierungsmedium sowie den Induktionszeitpunkt im Schüttelkolbenmaßstab zu optimieren und weitere potenziell optimierbare Prozessparameter zu identifizieren (z. B. die Stickstoffkonzentration). Es wurde mit 262 mg/l die höchste bisher in A. nidulans erreichte Psilocybinkonzentration gemessen. Weiterhin konnte das Potenzial von A. nidulans zur biotechnologischen Herstellung von Psilocybin verdeutlicht werden, da das Scale-up in den 7 l Bioreaktormaßstab erfolgreich durchgeführt werden konnte, aber auf Grund der geringeren Psilocybinkonzentration im Vergleich zur Schüttelkolbenkultivierung noch weitreichendes Optimierungspotenzial aufweist.

Die vorliegende Bachelorarbeit beinhaltet Voruntersuchungen zu einer neuartigen antiviralen Strategie auf Basis von Enzym inhibierenden Peptiden. Ziel ist es, Versuche dieser Methode in nicht pathogenen Systemen mit Bakterien und Bakteriophagen als Modellorganismen durchzuführen. Eine Methode zur Anwendung der Strategie wurde entwickelt und Versuche zur Wirksamkeit durchgeführt.

Smarte Systeme verändern unseren Alltag seit ihrem Aufkommen für die Fähigkeit zur Signalerfassung; Übertragung und, was noch wichtiger ist, Entscheidungen zu treffen und Anweisungen auf der Grundlage verfügbarer Informationen und einer Datenbibliothek zu erteilen. Meist aus Mikrosystemen hervorgegangen, haben Smart Systems heute immer mehr Kombinationen zwischen Mikrosystemtechnik und anderen Disziplinen wie Biologie, Chemie, Nanowissenschaften, Kognitionswissenschaften geschaffen. Eine neue Klasse von Nanomaterialien, sogenannte Smart Materials, die die Grundlage für solche Smart Systems bilden, hat in den letzten Jahrzehnten eine rasante Entwicklung genommen und auch von der modernen Gesellschaft miterlebt. Im Gegensatz zu herkömmlichen statischen Materialien sind intelligente Materialien strukturell und aktiv. Sie bieten Funktionen zur Selbstbetätigung, Selbsterfassung, Selbstheilung, Selbstmontage und Selbstanpassung; reagieren auf Umweltveränderungen und haben ein großes Potenzial für Anwendungen in vielen Bereichen. In den letzten Jahrzehnten haben sich die Anwendungen von intelligenten Materialien oder genauer gesagt stimuliresponsiven Molekülen immer schneller und breiter in biologischen, pharmakologischen, medizinischen und klinischen Bereichen ausgebreitet. Eine der bekanntesten Anwendungen sind Nanocarrier für die gezielte Verabreichung von Arzneimitteln. Um einen zielgerichteten Transport von Pharmazeutika zu erreichen, werden mit spezifischen Einheiten wie Antikörpern, Genfragmenten, Peptiden etc. modifizierte Träger eingesetzt, die das Medikament vor Abbau schützen, die Zielzellen spezifisch erkennen und vor allem das Medikament unter einzigartigen Stimuli freisetzen .In dieser Arbeit versuchen wir, chemische Konjugate zu etablieren, die durch harmloses sichtbares Licht mit einigen bioaktiven wirkstoffähnlichen Molekülen durchstimmbar sind. Eine neue Klasse von photoschaltbaren Molekülen: Donor acceptor Stenhouse adducts (DASAs) werden zu unserem wunderbaren Kandidaten für ihren photoempfindlichen Schalter der Molekülstruktur und die entsprechende Löslichkeit in organischen und wässrigen Lösungsmitteln. Um einen Drug-Delivery-Prozess abzuschließen, muss vorab das Transportverhalten des Drug-Carriers getestet werden. Das erste Ziel dieser Arbeit ist es, die Transportmöglichkeit von DASAs zwischen organischer und wässriger Phase und sogar einen konsistenten Transport durch eine wässrige Phase von einer organischen Phase zur anderen in einer spezifischen Dreiphasensäule zu untersuchen. Der zweite Zweck ist die Synthese von bioaktiven, wirkstoffähnlichen DASA-Konjugaten. Das medikamentenähnliche Dihydropyrimidinon (DHPM)-Derivat wird zuerst für unsere DASA-donor-modifikation ausgewählt aufgrund seiner Analogien zu Dihydropyridin (DHP)-Derivaten, die bereits häufig als Medikamente gegen Kardiomyopathie verwendet werden. Die sogenannten DHPM-DASA-Konjugate werden dann mit dem DHPM-funktionalisierten Donor erzeugt. Die Modifikation des DASA-Akzeptors erfolgt durch die berühmte Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC). 1,2,3-Triazol wird verwendet, um drei Arzneimittel-Zwischenprodukte und normalen DASA-Akzeptor zu kombinieren, um einen Click-DASA-Akzeptor zu erzeugen, der auch für die nächste Synthese von wirkstoffähnlichen Click-DASA-Konjugaten wichtig ist. Die Charakterisierung dieser beiden wirkstoffähnlichen DASA-Moleküle wird auch durchgeführt, um die ursprüngliche lichtempfindliche Eigenschaft von DASA-Molekülen zu verifizieren. Mit beiden positiven Ergebnissen der Synthese und Charakterisierung bringen wir sie zum Transporttest mit Dreiphasensäule. Abgesehen davon, dass wir am Ende dieser Arbeit auch versucht haben, ein komplexes wirkstoffähnliches Click-DHPM-DASA mit sowohl der DHPM-Gruppe als auch der Wirkstoff-Zwischengruppe zu synthetisieren.

Bei COVID-19 handelt es sich bisher meistens um eine relativ milde Erkrankung. Sie ist aber hochansteckend und kann bei ungünstiger Veranlagung (Genetische Faktoren, Alter, Gesundheitszustand) einen schweren bis tödlichen Verlauf haben [3]. Der bisherige Pandemieverlauf lässt sich anhand der Red Queen Hypothese und der Muller’s ratchet Theorie erklären und die Versuchsergebnisse der Arbeiten mit Phagen unterstützen dies. Die steigende Virulenz zu Beginn der Pandemie als gar keine oder wenige Leute geimpft waren, konnte durch die Entwicklung der Phagen bei der large Scale Passage repräsentiert werden. Die verringerte Virulenz in den jetzigen Mutanten kann ein Einfluss des Impfstoffes sein und wird durch den Effekt der Plaque to Plaque Experimente repräsentiert. Jedoch ist der weitere Verlauf der SARS-CoV-2 Pandemie nicht vorhersehbar. Im Rahmen der Phagenexperimente konnte beobachtet werden, dass es plötzlich zu einem unerwarteten Anstieg oder Abfall der Fitness kommen kann. Im Rahmen dieser Masterarbeit sollte herausgefunden werden, ob die RQH und Muller’s ratchet Theorie auf T4 Bakteriophagen anwendbar sind. Dazu sollte geprüft werden, ob sich die Theorien auf DNA-Viren genauso auswirken, wie auf RNA-Viren. Untersucht werden sollte die Entwicklung der Fitness, die Veränderungen der Phagenkonzentration sowie der Verlauf der Wurfgröße von T4. Die Untersuchung der Parameter erfolgt unter Anwendung die Methode des Large Scale Passage (RQH) und Plaque to Plaque Assay (Muller’s ratchet). Zusätzlich sollte im Fall von large Scale Passagen die Burstzeit untersucht werden, während beim Plaque to Plaque der durchschnittliche Plaquedurchmesser und die dazugehörige Wachstumsrate untersucht werden. Weiterhin sollten genotypische Veränderungen von T4 Bakteriophage im Laufe der Passagen anhand Gelelektrophorese analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Theorien nicht nur auf DNA-Phagen anwendbar sind, sondern dass sie einen ähnlichen Verlauf wie RNA-Viren aufweisen. Außerdem ist es wichtig zu erwähnen, dass der Korrektur Mechanismus der DNA-Phagen, sowie die Größe der Phagen, einen merklichen Einfluss auf die Untersuchungsergebnisse hat. Im Vergleich zu RNA Viren sind die theoretisch vorhergesagten Effekte bei den untersuchten DNA-Phagen nicht so stark ausgeprägt, aber immer noch sichtbar. Weiterhin konnte durch die Untersuchung einzelner Plaques gezeigt werden, dass es innerhalb einer Population diverse Unterschiede der Wachstumsraten gibt und die damit einhergehenden Plaquegrößen sehr verschieden sind. Im Fall von large Scale Passagen wurde eine vergleichbare Tendenz bzw. ein Fitnessanstieg wie bei den RNA Viren festgestellt und die Anwendbarkeit der Theorie bestätigt. Für einen genaueren Vergleich müsste die Anzahl der Versuche noch deutlich erhöht werden. Die Analyse durch die Gelelektrophorese, um die aufgetretenen Mutationen zu beobachten, was eine Bestätigung der Ergebnisse geben könnte, war wegen der ghmc in T4 DNA nicht möglich. Hier könnte die Verwendung einer klonierten T4 DNA das Problem lösen. Dieser Schritt wäre jedoch sehr zeitaufwendig und es besteht die Möglichkeit, dass die ghmc Struktur von T4 einen Einfluss auf die Fitness hat.

Der Verlauf der viralen Fitness von Phagen bei large Scale Passagen wurde schon in den 90er Jahren mit humanpathogen RNA-Viren untersucht. Aufgrund der hohen Pathogenität von verschiedenen Viren, die in den letzten Jahren Bekanntheit erlangten, wurden im Rahmen dieser Arbeit Experimente über der viralen Fitness bei large Scale Passagen mit harmlosen DNA-Viren wie Bakteriophagen T7 durchgeführt. Die Experimente zeigen, dass die Untersuchung der viralen Fitness von T7 bei large Scale Passagen teilweise zu einer Fitnesserhöhung führt. Es folgt dann eine Abnahme der Burstzeit, eine Zunahme der Wurfgrößenrate sowie eine Minderung des Phagentiters im Laufe der Passagen. Zusätzlich zeigt die DNA-Analyse unterschiedliche Mutationen des Genoms im Laufe der Passagen.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung unterschiedlicher Prozesseinflüsse auf das Cell-Sheet-Layer (CSL)-System und ein anschließender Vergleich des mit Zellen besiedelten Systems mit einer herkömmlichen In-vitro-Zellkokultur. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die bisher verwendeten Bedingungen zur Zellbesiedlung und Perfusion der CSL optimal sind, eine Übertragung des Kollagens durch den Thermoforming-Prozess stattfindet und die Zellen auf diesen Strukturen erfolgreich adhärieren können. Außerdem sollten alternative Methoden der Durchbrucherzeugung auf dem CSL entwickelt werden, die die Akkumulation bzw. das Durchwandern der Zellen von der einen auf die andere CSL-Seite verhindern. Dazu wurde eine manuelle Methode entwickelt, welche vor der Besiedlung Durchbrüche stanzt, und eine Methode bei der ein ferngesteuerter Nanoroboter die Durchbrüche nach der Besiedlung erzeugen kann. Bei der Betrachtung der Perfusionsbedingungen wurden verschiedene Inkubationszeiten und Fließraten im Bioreaktor auf ihren Einfluss der Zellen anhand von Live-Dead-Färbungen geprüft sowie unterschiedliche Pumpensysteme verwendet. Für die Untersuchung der Kollagenübertragung wurde mittels immuncytochemischer Färbungen versucht das Kollagen auf den CSL nachzuweisen. Bei der Untersuchung der Übertragung während des CSL-Herstellungsprozess wurde eine Coomassiefärbung durchgeführt und mögliche Einflüsse des Kollagens und der Folie getestet. Als abschließender Versuch wurde die Funktionalität der HepG2 Zellen mit den im Rahmen dieser Arbeit erarbeiteten Optimierungen anhand der Albuminsekretion im 2D und CSL-System getestet. Betrachtet man die Inkubation und die Durchbrüche, kann man zu dem Schluss kommen, dass die Perfusion mit dem automatisierten Pumpensystem sowie die Erzeugung der Durchbrüche mit dem Nanoroboter die besten Ergebnisse brachten. Die Upcyte® Zellen zeigten sich anfälliger bei der Perfusion als es bei den immortalisierten Zelllinien beobachtet wurde. Im abschließenden Vergleich des CSL-Systems unter Perfusion mit einer 2D-Kultur ergab die Auswertung der Albuminwerte nach 24 Stunden eine stark erhöhte Funktionalität der Zellen in dem System. Angesichts dieser Ergebnisse liegt die Schlussfolgerung nahe, dass das System unter den richtigen Bedingungen eine deutliche Verbesserung gegenüber dem herkömmlichen In-vitro-2D-Kulturen bietet.

Organ-on-a-Chip (OoaC) Mikrosysteme sind neuartige Testinstrumente mit perfundierten 3D-strukturierten Zellkulturen, welche die Physiologie von Organen nachbilden. Genaue Kontrolle der mikrophysiologischen Bedingungen und Verwendung von mehreren Zelltypen sind wesentlicher Fortschritte im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Zellkulturen. Der Einsatz von OoaCs verspricht eine Optimierung/Beschleunigung der Wirkstoffentwicklung, die Ermöglichung personalisierter Medizin und eine Verminderung des Bedarfs an Tierversuchen. Zwei OoaC-relevanten Modulen wurden konstruiert: (a) Ein modularer Luftblasen-Entferner; (b) eine programmierbare Mehrkanalpumpe für die Zugabe von Nährstoffen, Hormonen und sonstigen bioaktiven Substanzen. (a) Luftblasen in OoaCs sind zytotoxisch und behindern die Perfusion. Sie werden entweder infundiert oder entstehen aus Lufteinschlüssen während Temperatur- oder Druckschwankungen. Ein mikrofluidischer Blasenentferner wurde gebaut, dessen mikroporöse Membran (Porendurchmesser: 0,3 [my]m) die Luftblasen zu einer 1 mm dicken PDMS-Membran lenkt die sie in eine Vakuumkammer führt. Normaler Perfusion (0-150 [my]l/St.) ergab eine effektive Blasenentfernung (Halbwertszeit: 12 Min.). Weiter zeigten sich kaum Effekte der Betriebsparameter (Perfusionsrate und fluidischer Widerstand) auf die Blasenentfernung. COMSOL-Modelle der Blasenentfernung entsprachen den experimentellen Beobachtungen. Eine dünnere, semiporöse PDMS-Membran beschleunigte die Blasenentfernung um das Doppelte. Simulationen zeigten, dass die 1 mm dicke PDMS-Membran, die -900 mbar ausgesetzt wird, den Luftgehalt des Mediums um 36 % vermindert, was stromabwärts Luftblasen reduzieren könnte. Zum Schluss wurde ein Konzept des "non-porösen Schwamms" präsentiert, zur Luftblasenentfernung mit PDMS ohne externe Vakuumleitungen. (b) Eine programmierbare Mehrkanalpumpe wurde entworfen, um physiologiegerechte Abgabe von komplexen Medien an OoaCs zu realisieren. Schrittmotoren, kontrolliert von einem Arduino-Mega-2500 Mikrokontroller, betätigen Spritzen mit den jeweiligen Medienkomponenten. Zur Eingabe von Infusionsmustern wurde eine Excel-ähnliche Benutzerfläche erstellt. Eine Windows GUI Konsole wurde in Visual Basic 2017 und Python 3.7 programmiert zur Konversion der Infusionszeitpläne in ausführbare Pumpdateien. Ein Arduino Sketch (in Arduino C) diente zur elektronischen Ansteuerung der Schrittmotoren.

Im Gegensatz zu RNA-Viren wurden DNA-Viren bisher wenig unter dem Gesichtspunkt von Muller's ratchet untersucht. Der Bakteriophage T7 soll dahingehend unter Aussetzung von genetic bottlenecks auf die Theorie von Muller's ratchet auf mehrerer Parameter untersucht werden. Zusätzlich wird die Methode des Plaqueto-Plaque-Assays für zukünftige Arbeiten evaluiert. Die Experimente zeigen, dass die Theorie von Muller's ratchet auf den DNA-Phagen Escherichia Virus T7 angewendet werden kann. Es zeigt sich eine Abnahme der Phagenkonzentration, des Plaquedurchmessers und der Plaquewachstumsrate.

Smart materials sind die Vorreiter der modernen Forschung und medizinischen Versorgung. Unter ihnen sind vor allem die schaltbaren Oberflächen von Bedeutung, insbesondere durch ihre nicht-invasiven Eigenschaften. Zusammen mit Funktionalisierungen über Elektrizität oder Temperatur kommen besonders photoswitchable - also lichtschaltbare - Oberflächen zur Geltung. Neben Azobenzenen und Spiropyranen fallen donor acceptor Stenhouse adducts, kurz DASA, ins Gewicht. Dies beruht darauf, dass DASA mit Licht des sichtbaren Spektrums geschaltet werden können und kein für Zellen schädliches UV Licht benötigen. Die niedrigen Herstellungskosten und die Stabilität der DASA sprechen für sich. Diese Arbeit hat sich zum Ziel gesetzt, die Möglichkeiten der Anwendung dieser Verbindungen als steuerbare Zellwachsoberfläche auf verschiedenen Polymeren zu erörtern. Hierzu wurden verschiedene Konzentrationen und Zusammensetzungen von DASA auf ihre Photoswitching-Fähigkeiten untersucht. Zusätzlich wurde auch die chemische Kompatibilität von DASA und biologischen Organismen über Zelladhäsion erforscht. Es wurden Oberflächen entwickelt auf denen jeweils für verschiedene Zeitfenster L929 Zellen inkubiert wurden. Zuletzt wurden Experimente durchgeführt, die durch das Beobachten der Bildung des Aktinskeletts untersuchten, inwiefern das Serum in dem Zellmedium auf die Zelladhäsion Einfluss nimmt. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Untersuchung zur Zelladhäsion auf photoswitching Polymeren dargestellt.

In den letzten Jahrzehnten haben sich viele Forschungsprojekte mit der Untersuchung neuraler Stammzellen beschäftigt, um die Neurogenese besser zu verstehen und umwirksameTherapien zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen sowie von Hirn-und Rückenmarksverletzungen zu entwickeln. In der vorliegenden Studie wurden menschliche neuronale Stammzellen (NSCs) in Bezug auf Zellexpansion und Neurogenese untersucht. Die neuralen Stammzellen wurden erzeugt, indem humane embryonale Stammzellen (H9-Stammzelllinie) über duale SMAD-Inhibition neuralinduziert wurden. NSCs wurden entweder als konventionelle adhärente Monolayerkultur (2D) oder als Neurosphärenkultur (3D) kultiviert und die Multipotenz und der Differenzierungszustand der Zellen wurde durch Anwesenheit von Marker Proteinen untersucht. Hierbei kam die Antikörper-basierte Immunfluoreszenztechnik und Laserscanningmikroskopie zur Anwendung. Verschiedene Kultivierungs- und Differenzierungsmethoden sowie Versuchsbedingungen (Medien, Neurotrophine, verschiedene ECM-Substrate, Zelldichte, Konfluenz, Inkubationsdauer) wurden getestet, um eine effiziente Differenzierung der NSCs in Neuronen zu erreichen. Die mit dibutyrl-cAMP- induzierten neuralen Stammzellen in der Monolayer-2D-Kultur differenzierten in unreife Neuronen, die durch Expression von ß3-Tubulin identifiziert wurden. Außerdem konnte eine Stimulation der Gliogenese (GFAP-positive Astrozyten) gezeigt werden. Letztendlich resultierte eine optimierte Neurosphärenkultivierung inder Erzeugung von MAP2-positiven Neuronen, welche hauptsächliche reife Neuronen repräsentieren. Dies zeigt, dass die in dieser Studie entwickelte Methode als Modell der neuronalen Entwicklung im Vergleich zur 2D-Kultur überlegen ist. Am Ende wurden die elektrischen Aktivitätender auf MEA-Chips gezüchteten 2D-differenzierten NSCs beobachtet. Es konnten jedoch keine elektrischen Aktivitäten (Peaks) nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass die erzeugten Neuronen nicht reif genug waren. Stichwörter: 2D Monolayer, 3D-Neurosphäre, db-cAMP-neuronale Differenzierung, humane neurale Stammzellen, Immunfluoreszenz, Laserscanningmikroskopie, Neurale Stammzellkultur, Neurogenese, MEA-Messung

In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des Tetrazoliumsalzes 5-Cyano-2,3-ditolyl tetrazoliumchlorid (CTC) eine Nachweismethode für Bakterien entwickelt.

Die toxische Wirkung von Acetaminophen basiert auf dem Metaboliten N-Acetyl-p-benzochinonimin, welcher bei der Oxidation von Acetaminophen in einer Phase-I-Reaktion über das CYP450-Enzymsystem gebildet wird. Das Ziel der Arbeit bestand darin, die Auswirkungen wiederholter Acetaminophen-Applikationen auf humane upcyte® Hepatozyten über einen Zeitraum von 31 Tagen aufzuzeigen. Insbesondere sollten die Effekte physiologisch relevanter Acetaminophen-Konzentrationen (50 [my]M, 100 [my]M, 250 [my]M) mit höheren potenziell toxischen Acetaminophen-Konzentrationen (2 mM, 5 mM) auf humane upcyte® Zellen verglichen werden. Hierzu wurde täglich die Zellfunktion in Hinblick auf die Albumin-Sekretion und die LDH-Sekretion als Maß für die Acetaminophen induzierte Hepatotoxizität aus den Medium-Überständen bestimmt. Zudem sollte die Eignung der upcyte® Hepatozyten für Toxizitätsstudien dieser Art getestet werden. Durch die wiederholten Applikationen physiologisch relevanter Acetaminophen-Konzentrationen auf die upcyte® Hepatozyten konnte über den Inkubationszeitraum eine Steigerung der Zellfunktionalität in Hinblick auf die Albumin-Sekretion gezeigt werden. Im Gegensatz dazu führen hohe Konzentrationen (2 mM und 5 mM) zu einer starken Einschränkung der Zellfunktionalität. Entstandene Zellschädigungen durch die APAP-Applikationen zeigten sich im LDH-Assay reversibel. Die verwendeten upcyte® Hepatozyten wiesen eine lange Lebensdauer auf, wodurch die Langzeitkultur ermöglicht wurde.

Ziel der vorliegenden Bachelorarbeit ist es, ein Konzept zum Designen von einzelsträngigen DNA-Oligomeren zu entwickeln, um aus diesen nach einigen wenigen Arbeitsschritten Texte in einer Abfolge von DNA-Basen eines DNA-Doppelstrangs zu codieren. Diese DNA-Konstrukte sollen als funktionale Markierung an Gegenständen aller Art angebracht werden und produktspezifische Informationen codieren. Zur Überprüfung der Umsetzbarkeit wurde ein exemplarischer Satz an Oligomeren designt und verschiedene Versuche zur Synthese durchgeführt. Das gewünschte Produkt konnte nicht synthetisiert werden, da die Oligomere aufgrund ihres Designs über längere Zeit instabil wurden und so hauptsächlich unerwünschte Nebenprodukte und Abbauprodukte auftraten.

Das Donor-Acceptor-Stenhouse-Adduct (DASA), eine neue Klasse von photochromen Molekülen, die sowohl ihre Farbe als auch ihre physikalischen Eigenschaften wie Polarität und Löslichkeit bei Einwirkung von sichtbarem Licht verändern können, hat in letzter Zeit immer mehr Aufmerksamkeit auf die Entwicklung intelligenter Materialien und Medikamente gelenkt. Bisher werden fast alle Arten von DASA-Derivaten durch Ringöffnungsreaktion mit aktiviertem Furan nur auf einer Seite des DASA-Vorläufers hergestellt. In der vorliegenden Arbeit wird die Synthetische Methode zur Herstellung eines doppelt aktivierten Furankerns für die Durchführung einer Doppelseitigen Ringöffnungsreaktion mit Donor Aminen und zur Herstellung eines dimeren Donor-akzeptor-Stenhouse-Adducts entwickelt. Basierend auf der Standardmethode zur Synthese des Alkin-funktionalisierten DASA-Vorläufers und der Kupfer(I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition(CuAAC) wurden zwei Synthesestrategien entwickelt, um die Synthese des dimeren DASA-Vorläufers zu realisieren. Das resultierende Molekül wurde unter Verwendung von analytischen Standardtechniken gereinigt und vollständig charakterisiert. Dieser dimere DASA-Vorläufer zeigte die Fähigkeit, mit Donor Aminen zu reagieren, und führte wie alle DASA-Derivate einen Farbwechsel sowie eine photoschaltbare Eigenschaft unter Bestrahlung mit sichtbarem Licht durch. Außerdem, es werden in dieser Arbeit auch dimere DASA-Vorläufer mit unterschiedlichen Längen von Linkeralkylketten synthetisiert. Das Ergebnis dieser Studie bietet eine neue synthetische Route der neuartigen Derivate von DASA.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Aufskalierung der 2-Photonen-Polymerisation anhand abstrahierter sinusoidaler Strukturen mit Materialien aus der Mikrosystemtechnik und der Biomedizintechnik erprobt. Mit speziell angefertigten Substraten aus SU-8, SUEX TDFS und UDMA wurde eine konkrete Anwendung für DLW-Erzeugnisse geschaffen. Es wurde eine Strategie entwickelt, die die CAD/CAM-Programmierung hochkomplexer Strukturen für die experimentelle 2PP-Anlage zugänglich macht. Es konnten passende Parametersätze für erfolgreiches direktes Laserschreiben für alle eingesetzten Materialien ermittelt werden.

Um die Bildung von Biofilmen auf Oberflächen zu verhindern, die sich im ständigen Kontakt zu Mikroorganismen befinden, gibt es verschiedene Wege. Eine neue Strategie beinhaltet den Einsatz von Tetraetherlipiden (TEL) als membrananaloges Spacersystem für Antifouling-beschichtungen. Diese Lipide sind Bestandteil der Zellmembranen von Archaeen, wie Sulfolobus solfataricus. Um das Haupt-TEL aus S. solfataricus zu gewinnen, wurde in dieser Arbeit das Standardmedium für deren Fermentation so angepasst, dass möglichst viel Biomasse in kurzer Zeit generiert werden kann. Nach dem Test einiger Basalmedien wurden verschiedene Hefeextrakte als Stoff- und Energiequelle getestet. Das beste Wachstum konnte dabei mit Hefeextrakten, bestehend aus kurzkettigen Peptiden erzielt werden. Zudem wurden unterschiedliche Zucker als zusätzliche Kohlenstoffquelle untersucht. Hierbei führten Stärke, Maltose, Malzextrakt und Saccharose zu den besten Ergebnissen. In Batch-Prozessen konnte durch Kombination des Hefeextrakts Ohly CPT und Saccharose die BTS, im Vergleich zum Standardmedium der DSMZ, mehr als verdoppelt werden auf 0,97 g/l. Zudem wurde das Maximum der OD600 bereits 26 Stunden vor der üblichen Fermentationsdauer erreicht, wodurch vor allem für Batch-Fermentationen im großen Maßstab ökonomische Vorteile entstehen. Das TEL wurde aus der Biomasse durch Soxhlet-Extraktion gewonnen und durch Flash-Chromatographie und Umkristallisation aufgereinigt. Anschließend wurde untersucht, ob das TEL durch Bakterien abgebaut wird. Dazu wurde es bis zu zwei Wochen einer E. coli-Kultur ausgesetzt. Ein Abbau des Lipids konnte dabei nicht festgestellt werden. Um ausschließen zu können, dass die Beschichtungen in der Praxis angegriffen werden, ist die Durchführung weiterer Tests über einen längeren Zeitraum und mit weiteren Mikroorganismen zu empfehlen. Zur Beschichtung von Oberflächen mit TEL wird eine Dispersion benötigt, in der die TEL flüssig kristalline Aggregate bilden. Es wurden Dispersionen aus verschiedenen TEL hergestellt. Um den Einfluss von Reinheit und Art der Lipide auf die Aggregatgröße zu ermitteln, wurden deren Durchmesser bestimmt. Es wurden zum Teil große Unterschiede zwischen den einzelnen Dispersionen festgestellt. Diese Untersuchungen sollen in Verbindung mit weiteren Tests zeigen, ob die Größe der Partikel die Qualität der von ihnen gebildeten Monolayer beeinflusst.

Die Leber hat einen großen Aufgabenbereich im menschlichen Körper. Zu ihren wichtigsten Aufgaben gehören die Entgiftung und der Abbau von Xenobiotika. Ein großer Teil dieser Stoffe wird durch das Protein CYP3A4, eine Monooxygenase aus der Familie der Cytochrome P450, verstoffwechselt. Diese Stoffe können jedoch auch induzierend oder inhibierend auf den Proteinhaushalt wirken, wodurch es zu Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen Medikamenten kommen kann. Das Ziel der Arbeit bestand darin, unterschiedliche Kulturmodelle in ihrer Proteinexpression und -induktion zu untersuchen und zu vergleichen. Das dabei betrachtete Protein ist CYP3A4 und die betrachteten Modelle sind ein klassisches 2-D-Monolayermodell von Hepatozyten, eine 3-D-Kultur von Hepatozyten und eine Kokultur aus Hepatozyten und lebersinusoidalen Endothelzellen. Hierbei waren sowohl die Hepatozyten als auch die lebersinusoidalen Endothelzellen primäre upcyte®-Zellen. Die Kultivierungsmethode hatte einen großen Einfluss auf die Proteinexpression und -induktion, so konnten in der 3-D-Kultur und der Kokultur ein deutlicher Anstieg der Proteinmenge sowohl in den basalen, als auch in den induzierten Kulturen nachgewiesen werden. Weiterhin ergaben die Messungen, dass die Kokultur keine weitere Steigerung der untersuchten Parameter gegenüber der 3-D-Monokultur zeigte, wodurch sich das 3-D-Modell von Hepatozyten als beste Basis für die Untersuchungen von Wirkstoffinteraktionen eignet

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von ultrasensitiven HRP-Konjugaten für Assaysysteme. HRP-Moleküle wurden über PEG-basierte Vinylsulfon- und Amin-Linker miteinander vernetzt, um größere und damit leistungsstärkere Detektionsmoleküle zu synthetisieren. Dabei wurden die Reaktionsparameter pH-Wert, Verlinkungsreagenz, Reaktionszeit- und temperatur sowie Homogenisierungsmethode variiert und optimiert. Streptavidin konnte in situ direkt eingeführt werden, wodurch zeitraubende und verlust-bringende nachgestellte Reaktionen umgangen wurden. Untersuchungen zur sekundären und tertiären Vernetzung brachten große, leistungsstarke Konjugate hervor, die im Assay zu einer erheblichen Sensitivitätssteigerung führten. Die Produkte der Kopplung wurden mittels Größenausschlusschromatographie und Asymmetrischer Fluss Feld-Fluss-Fraktionierung, einer relativ neuen und auf diesem Gebiet noch kaum verwendeten Technologie, analysiert. Die Leistung im Immunoassay wurde anhand eines hCRP-ELISA getestet.

Das Ziel der Arbeit war es, ein Kokulturmodell aus primären upcyte® Hepatozyten und sinuosidalen Leberendothelzellen (LSECs) zu etablieren und zu charakterisieren. Die Schwierigkeit bestand insbesondere darin, eine Methode zum Mediumwechsel zu finden, die förderlich auf die Vitalität und Funktionalität beider Zellspezies wirkt. Hierzu wurden die Auswirkungen eines separaten, kompletten und eines Halbmediumwechsels auf zweidimensionale und dreidimensionale Mono- und Kokulturen hinsichtlich der Vitalität, Zellzahl und Albuminproduktion der Hepatozyten nach einer Woche erfasst. Zusätzlich wurden dieselben Bedingungen nach Wachstum der LSECs auf unterschiedlichen Matrigelen® getestet. Auf der Grundlage dieser Daten wurden die besten Bedingungen für die Kokultivierung über drei Wochen ausgewählt. Vorversuche mit 7 Tagen Wachstum zeigten, dass die Hepatozyten als auch die LSECs in der Kokultur eine gute Vitalität (˜70%) aufwiesen. Die Proliferation der Hepatozyten in der 3D-Mono und Kokultur war aufgrund der Scaffoldkultivierung vermindert. Jedoch konnte eine deutlich gesteigerte Albuminproduktion in der 3D Mono- und Kokultur gegenüber der 2D Monokultur nachgewiesen werden. Versuche mit Matrigel/Medium Mix als extrazelluläre Matrix für das LSEC-Wachstum konnten eine nochmalige Steigerung der Albuminproduktion in den Kokulturen gegenüber 3D-Monokulturen aufweisen; jedoch war die Vitalität der LSECs ungenügend. Der Halbmediumwechsel stellte sich als die günstigste Bedingung für eine Langzeitkokultivierung heraus, da hier vor allem die Albuminproduktion am höchsten war. Die Vitalität der Hepatozyten war in der Langzeitkultivierung konstant, während die LSECs nur über zwei Wochen stabil waren. Die Kokulturen zeigten eine konstante Albuminproduktion über 21 Tage, die gegenüber der einfachen 2D-Monokultur etwa doppelt so groß war. Bei den LSECs konnten auch nach 2 Wochen Kokultivierung noch Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie nachgewiesen werden, was auf den differenzierten Zellzustand schließen lässt. Zusätzlich bildeten die LSECs während der Kokultivierung mit Hepatozyten Kapillaren aus; ein Hinweis auf eine parakrine Interaktion zwischen LSECs und Hepatozyten. Bei in vitro Wirkstofftests spielt es eine wichtige Rolle, mit einem auch in vivo relevanten Lebermodell zu arbeiten. Eine etablierte und charakterisierte 3D Kokultur kann dies besser darstellen als eine Monokultur.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Strukturierungsfähigkeit nativer Proteine wie Kollagen oder Fibrinogen und verschiedener Blutproben mittels Multi-Photonen-Polymerisation ohne Zugabe eines Photoinitiators getestet. Es wurden Rasterstrukturen mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten und Laserleistungen hergestellt. Dabei konnte herausgefunden werden, dass die Erstellung erhabener Strukturen ohne die Zugabe eines Photoinitiators unter den getesteten Parametern ausschließlich aus humanem Blutplasma möglich ist. Es wird angenommen, dass bei Kollagen und Fibrinogen andere Mechanismen, wie Multi-Photonen-Ionisation oder das Verdampfen des Materials aufgrund des unerwartet hohen Wärmeeintrags zu den beobachteten muldenartigen Strukturen führten.

In dieser Arbeit geht es zum einen darum, die Grundlage für den Entwurf von Modulen für die GEMOCO (Gene module combinatorics) Strategie zu schaffen. Dafür soll eine Bibliothek von DNA-Modulen entwickelt werden, welche frei kombinierbar sind. Dazu werden bekannte Proteinsequenzen näher betrachtet, um anschließend einen degenerierten Code zu designen, welcher mit größtmöglicher Wahrscheinlichkeit von einem Bakterium codiert werden kann. Zum anderen geht es um die praktische Umsetzung des Klonierens derartiger Module. Es werden self-assembly Techniken unter Verwendung von tailed Primern oder dem Einsatz von T4-DNA-Polymerase untersucht. Mit diesen Techniken sollen die entwickelten Module später kloniert werden.

Ziel dieser Arbeit war es, eine Alternative zum Mikrotiterplatten-basierten AlamarBlue®-Assay auf der Basis einer tropfenbasierten mikrofluidischen Plattform zu entwickeln. Um alle notwendigen Verfahrensschritte des etablierten Assays auf die mikrofluidische Plattform übertragen zu können, wurde eine Reihe funktioneller mikrofluidischer Module entwickelt und umfassend getestet. Eine Mikrocontroller-basierte Steuereinheit zum aktiven Dosieren der AlamarBlue®-Reagenz wurde im Rahmen der Masterarbeit etabliert. Der Einfluss von Phenolrot und Perfluodecalin auf die Fluoreszenzintensitäten bei unterschiedlichen Zellkonzentrationen wurde ebenso untersucht wie die potentielle toxische Wirkung von Tetradekan auf die Viabilität der verwendeten Zelllinie. Umfangreiche Untersuchungen zum Vergleich des etablierten Mikrotiterplatten-basierten AlamarBlue®-Assay zu dem im Rahmen der Masterarbeit entwickelten tropfenbasierten Assay bewiesen die Funktionalität der neuen mikrofluidischen Module und Protokolle auch als Basis für weitergehende Anwendungen.

Für die Tumorentstehung und Progression ist neben der genetischen Veränderung die Wechselwirkung mit der Mikroumgebung entscheidend. Aus diesem Grund ergeben sich für die Etablierung eines organotypischen 3D-Tumormodells zwei wesentliche Anforderungen. Für eine biomechanische Optimierung muss die Mechanik des nativen Tumors und des gesunden Gewebes bekannt sein (materialseitiger Anspruch). Außerdem müssen die zellulären Zusammenhänge und Wechselwirkungen zwischen entarteten und nicht entarteten Zellen aufgeklärt werden (biologischer Anspruch). In der Arbeit wurden mechanische und histologische Untersuchungen auf zelluläre und suprazelluläre Ebene durchgeführt. Für die mechanische Untersuchung an entarteten und nicht entarteten Einzelzellen des Brustepithels wurde die kolloidale Kraftspektroskopie mit dem AFM angewandt und die Histologie durch Färbung des Aktinskeletts beurteilt. Für die Untersuchung von Brusttumorgewebe und gesundem Brustgewebe der Maus, wurde die Kraftspektroskopie mit einem mikromechanischen Testsystem und für die Histologie eine HE-Färbung und Kollagen-Färbung durchgeführt. Die Tumorzelllinie MDA-MB-231 (0,8 - 15,4 kPa) war signifikant weicher als die gesunde Zelllinie MCF-12A (2,6 - 19,3 kPa). Zurückzuführen ist dies auf eine geringere Aktinpolymerisation in Folge der EMT. Das Brusttumorgewebe war mit einem E-Modul-Bereich von 12,4 - 271 kPa signifikant steifer als das gesunde Gewebe (0,8 - 10,3 kPa). Außerdem besaß das Tumorgewebe eine größere mechanische Inhomogenität. Die Gewebeversteifung entsteht durch eine gestiegene Kollagenablagerung in der ECM (Desmoplasie). Die erhöhte Kollagenablagerung sorgt für die Bildung von Integrin-Clustern. Durch das Mechanosensing der Zellen wird über das Zytoskelett, durch die Cluster, die Genexpression verändert und bewirkt eine weitere Versteifung der ECM durch Produktion von ECM-Komponenten durch Tumorzellen und Stromazellen. Damit existiert eine direkte Verbindung der genetischen Faktoren und Umgebungs-Faktoren für eine Tumorentwicklung. Mit der LCM-Plattform kann ein Scaffold-basiertes 3D Modell im Bereich der Tumorsteifigkeit erstellt werden. Für die Untersuchung der mechanischen Auswirkung der Mikroumgebung auf Tumorzellen ist eine Monokultur möglich. Jedoch sollte für Untersuchung neuer Therapeutika die Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und Stromazellen berücksichtig werden. Dazu eignet sich eine Cokultur, für eine bessere in vivo Annäherung.

Mikroorganismen treten in der Natur fast immer in Form von Biofilmen auf verschiedensten Oberflächen auf. Aber auch auf medizinischen Geräten und auf Implantaten können sich Biofilme bilden, was im menschlichen Körper zu Infektionen und Entzündungen, oder zum Funktionsverlust von Implantaten führen kann. Aus diesem Grund gewinnt die Entwicklung von Antifouling-Strategien zunehmend an Bedeutung. Da die Bildung eines Biofilmes durch die Adhäsion von Bakterien an die Oberfläche initiiert wird, beruhen die Strategien immer häufiger auf der Unterbindung der Adhäsion. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von physikochemischen Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien auf die bakterielle Adhäsion untersucht. Dazu wurden dynamische Adhäsionskinetiken, durch welche sich realitätsnahe Bedingungen schaffen ließen, mit vier verschiedenen Konzentrationen einer Mischkultur aus Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis durchgeführt. Als Modelloberflächen dienten mit TEGO®Phobe beschichtete Objektträger, welche im Sauerstoffplasma funktionalisiert wurden, um eine abgestufte Benetzbarkeit und Ladung der Oberfläche einzustellen. Durch die Ermittlung von zeit-und konzentrationsunabhängigen Parametern sollte schließlich eine materialspezifische Bewertung der Modelloberflächen ermöglicht werden. Die Untersuchungen ergaben, dass die bakterielle Adhäsion abhängig von der Zeit, von der Bakterienkonzentration und von den physikochemischen Eigenschaften der Biomaterialoberfläche ist. So wurde durch Extrapolation der Oberflächenbesiedlung bei sehr niedrigen und bei unendlich hohen Bakterienkonzentrationen festgestellt, dass der physikochemische Einfluss der Materialoberfläche mit steigender Bakterienkonzentration abnimmt. Bei sehr geringen bis moderaten Konzentrationen ist nachweislich die Affinität der Mischkultur zu sehr hydrophilen Oberflächen deutlich geringer als zu hydrophoberen Oberflächen. Dieser Effekt beruht vermutlich auf unterschiedlichen Wasserstrukturen, welche sich abhängig von der Benetzbarkeit der Oberfläche ausbilden. Für die Entwicklung neuer Antifouling-Konzepte ist es demnach empfehlenswert, den Einfluss der Hydrophilie von Biomaterialien zu berücksichtigen. Jedoch muss beachtet werden, dass die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse nur für die eingesetzten Infektionserreger und die gewählten Systembedingungen gültig sind.

Innovative Forschungsansätze verfolgen das Ziel, dreidimensionale zelluläre Aggregate unterschiedlicher Ursprungsorgane in sogenannten "Body-on-a-Chip"- Systemen zu assemblieren. Daher soll in vorliegender Arbeit ein Untersuchungsmodell zur Freisetzung eines Ca(2+)-Kanalblockers aus einer Wirkstoffvorstufe durch Hepatokarzinom-Zellen, die in Polycarbonatscaffolds organomimetisch kultiviert wurden, etabliert werden. Dazu wurde die Umsetzung der diacetylierten Vorstufe des Ca(2+)-Kanalblockers Dihydropyrimidin (DHPM) in scaffoldkultivierten HepG2-Kulturen zeitlich und quantitativ mit Hilfe von HPLC/MS Analytik untersucht. Entscheidend für die Stabilität der Wirkstoffvorstufe ist die Wahl eines geeigneten Lösungsmittels, in dem die diacetylierte Vorstufe des DHPMs über einen Zeitraum von 6 h beständig ist. Basierend auf Stabilitätsuntersuchungen in verschiedenen Medien wurde DMSO/PBS als geeignetes Lösungsmittel für weiterführende Untersuchungen eingeschätzt. Eine Metabolisierung des in DMSO/PBS gelösten diacetylierten DHPMs zu den Produkten mono- und deacetyliertem DHPM durch HepG2-Zellen konnte quantitativ nachgewiesen werden. Die toxische Wirkung der Substanzen auf die Hepatokarzinom-Zellen wurde mittels etablierter zellbiologischer Methoden überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass höhere Konzentrationen als 10 [my]g/ml des diacetyliertem DHPMs die Vitalität der Zellen negativ beeinflussen. Im weiteren Teil der Arbeit wurde die inhibierende Wirkung von DHPM und dessen di- und monoacetylierte Vorstufen auf die in Kardiomyozyten lokalisierten Kalziumkanäle analysiert. Im Bezug dazu wurden kontrahierende Kardiomyozyten aus murinen P19-Zellen differenziert und die Kanalblockeraktivität mikroskopisch und mittels Multielektrodenarray (MEA) untersucht. Eine inhibierende Wirkung der Ca(2+)-Kanäle durch Applikation von DHPM wurde dabei detektiert. Die Zugabe von di- und monoacetyliertem DHPM zeigte keinerlei Beeinflussung der Kanalblockeraktivität. Abschließend wurde ein chipbasiertes, gekoppeltes Untersuchungssystem beider Zellkulturen auf Basis festgelegter Randbedingungen konzipiert. Dadurch ist es in Zukunft möglich, die dreidimensionalen zellulären Aggregate beider Ursprungsorgane in einem sogenannten "Body-on-a-Chip"-System zu kultivieren.

In der vorliegenden Arbeit sollen Technologien für die Nutzung von Cell-Sheet-Layer-Systemen in der Zellkulturtechnik oder dem Tissue Engineering entwickelt werden. Exemplarisch soll dies für die biologischen Systeme "Leber" und "hämatopoietische Stammzellnische" erfolgen. Für das Tissue Engineering der Leber werden Technologien beschrieben, welche eine lokal begrenzte chemische Oberflächenmodifikation im und nach dem Mikrothermoformprozess ermöglichen. Diese Technologien werden mit verschiedene Stoffen in Zellkulturexperimenten evaluiert und anschließend miteinander verglichen. Dabei konnte die Methode des "3D microcontact printing" als Methode zur gezielten Zelladhäsion etabliert werden. Des Weiteren wird ein Prinzip zur gezielten Stapelung thermogeformter Folien demonstriert. Dabei zeigte sich, dass das Prinzip der Faltkantenpositionierung eine vielversprechende Methode zur gezielten Stapelung thermogeformter Folien ist. Für die Nutzung von Cell-Sheet-Layer-Systemen in der Zellkulturtechnik wird gezeigt, inwieweit Heißprägen und Mikrothermoformen zum Strukturieren von thermoplastsichen Folien geeignet sind. Beide Methoden werden zum Nachbau der hämatopoietischen Stammzellnische eingesetzt. Für diese physikalische Strukturierung der Folien sind mikrostrukturierteWerkzeuge notwendig. Darum wurden aus biologischen Proben Bilddaten des trabekulären Knochens und des Knochenmarks gewonnen und diese Strukturen zum Design photolithografischer Masken genutzt. Für das Extrahieren der Strukturen aus Bilddateien werden verschiedene Algorithmen der Binärbilderstellung in MATLAB getestet. Dabei kamen Algorithmen zur Kantendetektion und zur lokalen Schwellenwertberechnung zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass für die Kantendetektion der Algorithmus nach Canny und für die lokale Schwellenwertberechnung der Algorithmus nach Niblack die besten Resultate erzielen. Die so extrahierten Strukturen konnten erfolgreich im Heißprägeprozess eingesetzt werden. Eine weitere Modifikation der so strukturierten Folien mit Topologien trabekulären Knochens konnte im Mikrothermoformprozess durchgeführt werden.

Die Kultivierung von Zellen in fortgeschrittener dreidimensionaler Zellkultur ist ein sich seit den letzten Jahren dynamisch entwickelndes Forschungsgebiet. Ein dabei kaum oder gar nicht untersuchter Forschungsgegenstand ist, inwieweit sich Zellen, die in polymeren 3D Scaffolds eingesät werden, sich in ihrer geometrischen Organisation nach bestimmten Regeln selbst organisieren d.h. eine räumliche Struktur ausbilden, die nicht rein zufällig ist. Speziell in den vorliegenden, nach oben offenen MatriGrid- Strukturen stellt sich die Frage, ob die zu beobachtenden Kanäle die Hypothese eines sich ausbildendenden Fluidsystems (Vaskularisierung) zur Ver- und Entsorgung der in 3D Kultur gebildeten, gewebeartigen Zellaggregate rechtfertigt. Durch die Vaskularisierung von Geweben wird in vivo die Arbeit des Blutgefäß- und des Gallenkanalsystems ermöglicht. Zur quantitativan Analyse der Zellstrukturen wurde in dieser Arbeit ein Algorithmus entwickelt, mit dessen Hilfe charakteristische Parameter dieser ermittelt werden können. Hierbei werden die Positionen der einzelnen Zellen innerhalb ihrer Zellstruktur über das Auswertungsprogramm Imaris aus LSM-Bildern extrahiert. Die erhaltene Punktemenge wird in Ebenen unterteilt, in welchen separat voneinander nach Abschnitten der entstandenen Kanal- und Hohlraumstrukturen gesucht wird. Diese Abschnitte werden anschließend zu den gesuchten Strukturen verbunden und aus ihnen die charakteristischen Parameter der untersuchten Zellkultur ermittelt und statistisch verglichen.