Studienabschlussarbeiten

Die tropfenbasierte Mikrofluidik ermöglicht die Isolierung und die Manipulation von einzelnen Zellen und Reagenzien innerhalb von dispergierten Kompartimenten. Diese moderne Technologie bietet umfangreiche Einsatzmöglichkeiten in den Bereichen der Chemie, der Biologie und der Medizin. Im Rahmen der Masterarbeit wurde die Funktionalität eines tropfenbasierten Mikrofluidik-Systems für die Etablierung eines alamarBlue®-Assays untersucht. Es wurden in einem tropfenbasierten Mikrofluidik-System Kompartimente mit unterschied-licher Verdünnung einer U-87MG Zellsuspension erzeugt. Darüber hinaus wurde den Tropfen ein definiertes Volumen des alamarBlue®-Farbstoffs zugegeben. Die Zugabe erfolgte mit einem mikrofluidischen Zudosiermodul. Durch die metabolische Aktivität der vitalen U-87MG Zellen wurde die nichtfluoreszierende Form des alamarBlue®-Farbstoffs, das Resazurin, in die fluoreszierende Form Resorufin umgewandelt. Die Vitalität der Zellen im Tropfen ist hierbei proportional zum Fluoreszenzsignal des einzelnen Tropfens. Für eine quantitative Fluoreszenzmessung von Tropfen in einem Schlauch, wurde ein Analysemodul bestehend aus einer Lichtquelle, einem Fluidikmodul und einer Detektionseinheit (Spektrometer oder PMT), aufgebaut und optimiert. Als Lichtquelle diente eine Laserdiode (525 nm) die über Lichtleiter mit dem speziell für tropfenbasierte Anwendungen entwickelten Analysemodul gekoppelt wurde. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte entweder mit einem Spektrometer oder mit einem Photomultiplier (PMT). Der Fokus der Untersuchungen lag auf der Steigerung der Sensitivität. Desweitern wurden im Rahmen der Arbeit alle Komponenten des tropfenbasierten Mikrofluidik-Systems und des Analysemoduls charakterisiert und optimiert. Die Validierung des Mikrofluidik-Systems basierte auf der Ermittlung der Zellvitalität mittels alamarBlue®-Assay. Mit Hilfe der Vitalitätsanalyse wurde z.B. ermittelt, ob ein zuvor erzeugter Zellgradienten effizient und zuverlässig mit dem tropfenbasierten Mikrofluidik-System generiert werden kann. Letztendlich wurden die Messergebnisse, die mit dem Spektrometer und dem Photomutliplier erfasst wurden gegenübergestellt und diskutiert.

In dieser Arbeit wurden drei Themengebiete bearbeitet. Zum einen die Entwicklung eines mikrofluidischen System zum Wachstum von form-anisotropen Edelmetall-Nanopartikeln aus Silber, zum anderen eine kontinuierliche mikrofluidische Metallisierung mit Palladium und andere Metalle von der Platin Gruppe. Zum Schluss erfolgte der Test dieser bimetallischen Nanopartikel für die biosensorische Analytik. Dabei wurde der Einfluss der Metallisierung auf die Bulk Sensitivität der Partikel mittels LSPR Messung bestimmt. Es wurde erstens bei der Wachstumsphase im Batch bessere Ergebnisse bei einer langsamen Zugabegeschwindigkeit von den Silberionen festgestellt. Dann wurde ein kontinuierliches mikrofluidisches System entwickelt, das ein effektives Wachstum von Silber-Nanopartikeln ermöglichte. Die Implementierung der Mikrofluidik in den Syntheseprozess von Metallnanopartikeln hat viele Vorteile, sowohl für die Qualität der Ausbeute der gewonnenen Endprodukte, als auch für die Herstellung des Herstellungsprozess selbst. In der Tat hat der Einsatz von Mikromischern eine bessere Kontrolle der Reaktionszeiten, eine deutliche Reduzierung der Diffusionswege und eine kontinuierliche Synthese ohne Mengenbegrenzung ermöglicht. Der Dean-Flow-Mischer mit seiner geometrischen Struktur führte durch Bildung von Verwirbelung zum guten Mischen von Lösungen vor allem bei sehr schnellen Flussraten. Diese Vorteile haben es ermöglicht, die Anforderungen an Geschwindigkeit und Effizienz beim Mischen der Lösungen zu erfüllen, die die reproduzierbare Synthese von Silber-Nanopartikeln ermöglicht haben. Als ein wichtiges Ergebnis wurde festgestellt, dass die Qualität der synthetisierten Prismen von vielen Synthesen beteiligter Parameter abhängt. Zunächst zeigte ein Vergleich zwischen den mikrofluidischen und den Batch Seeds, dass die mikrofluidischen Seeds durch bessere Ausbeute der Prismen bessere Keime für das sekundare Wachstum sind als die im Batch hergestellten Seedsb sind. Darüber hinaus führte der Aufbau eines Synthesesystems unter Verwendung von Mischer ohne Verweiler zur Herstellung einer Prismenlösung mit niedrigen Partikelgrößenverteilung und einer erheblichen Farbänderung der Lösung innerhalb eines Zeitintervalls von 2 Minuten (nach der Mischung). Durch die Verwendung eines Verweilers mit definierten Längen (für die Einstellung der Reaktionsdauer), erhielt man eine Prismenlösung, die eine bessere Partikelgrößenverteilung der Partikel aufweist. Ein weiterer Faktor, der die Qualität der synthetisierten Prismen stark beeinflusst hatte, war die Konzentration der verwendeten Ascorbinsäure-Lösung in dem Wachstumsschritt. Die Verwendung einer Konzentration von 50 mM führte zu Prismen mit höherem Durchmesser und einen wahrscheinlich hohen Anteil an sphärische Partikel. Die Reduzierung der Konzentration auf einen Wert von 20 mM führt zur erheblichen Verringerung der Peak der Intensität der maximalen Absorptionswellenlänge bei 400 nm und resultiert in dünneren Nanoprismen. Im Hinblick auf die Sekundärmetallisierung von Silber-Nanoprismen mit Palladium wurde zuerst als Modelsystem Vorversuche mit immobilisierten Gold-Nanopartikel durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass es eine sehr unregelmäßige Prismen-Wachstum mit Bildung von vielen Nebenprodukten stattfindet. Darüber hinaus könne man eine Erhöhung der Dicke des zweiten Metallschichts bei verringerter Reduktionsmittelskonzentration (AS) feststellen. Batch Vorversuche der Metallisierung von den Silberprismen zeigten eine Art Koaleszenz über die gesamte Prismen Oberfläche. Zwei Methoden wurden dafür verglichen, insbesondere die Batch-Methode gegen die mikrofluidische-Methode. Im Fall der Batch-Methode war eine Blau-Verschiebung des Absorptionsspektrums zu verzeichnen, während die Mikrofluidischen-Methode eine Rot-Verschiebung ihres Absorptionsspektrums zeigte. Hier wurde eine Wachstumsphase mittels eines Dean Flow Mischer, jedoch auf Basis von Polycarbonat, als Mischstruktur für diese Sekundärmetallisierung eingesetzt. Basierend auf dem gleichen Funktionsprinzip wie der aus Glas, hatte dieser die Besonderheit, mehr Einlässe zu haben und ermöglichte das gleichzeitige Mischen mehreren Edukten. Darüber hinaus lieferte er interessantere Ergebnisse, wenn die Mengen zwischen den Prismen- und Palladiumsalz variiert wurden. Wenn kleine Mengen Palladium (Verhältnis 1:100) mit den Prismen vermischt wurden, kam es zu einer globalen Aggregation auf der Oberfläche der Prismen, jedoch führte eine Erhöhung der Konzentration von Palladium (Verhältnis 1:10) zu einer fast vollständigen Zerstörung der Prismen durch Löcher, so dass die dreieckige Form nahezu verloren wurde. Die Sekundärmetallisierung mit Metallen der Platingruppe zeigte am Beispiel von Platin bei der photochiemischen Abscheidung, die Bildung von kleineren Partikeln auf der Oberfläche der Prismen. Die so erhaltenen bimetallischen Partikel wurden dann charakterisiert. Je nach Größe des verwendeten Prismas ihre Stabilität angesichts einer möglichen Agglomeration unterschiedlich beibehalten. Es konnte leider keine aussagekräftigen Schlussfolgerungen geliefert werden, da es an detaillierten weiteren Untersuchungen mangelte. Schließlich hat die Bestimmung des Einflusses der Metallisierung auf Silber-Nanoprismen für die Sensitivität (durch Brechungsindex Messung) gezeigt, dass trotz Ihres höheren LSPR, waren die mit Palladium metallisierten Silbernanopartikeln weniger empfindlich auf Änderungen des Brechungsindex der Umgebung im Vergleich zu reinen Silbernanopartikeln.

Mit Hilfe tropfenbasierter mikrofluidischer Verfahren können Hochdurchsatz-Screenings bis auf das Einzelzellniveau durchgeführt werden. Dieser moderne Ansatz bietet ungeahnte Möglichkeiten insbesondere im Bereich der Individualmedizin. Ziel dieser Masterarbeit war es, einen alamarBlue®-Assay in einem tropfenbasierten Mikrofluidik-System durchzuführen. Hierfür sollten die verwendeten KG-1 Suspensionszellen innerhalb des tropfenbasierten Mikrofluidik-Systems zunächst definiert verdünnt werden. Anschließend wurden Probentropfen generiert, wobei die Zellkonzentration in diskreten Schritten stetig erhöht wurde. Danach erfolgte die Zudosierung eines dem alamarBlue®-Farbstoff vergleichbaren Farbstoffs in die Tropfen. Die vitalen KG-1 Zellen metabolisierten diesen in eine fluoreszierende Substanz und gaben sie in das Zellkulturmedium ab. Nach einer Inkubation von 4 bzw. 22 h wurde die Fluoreszenz der einzelnen Probentropfen gemessen, damit eine quantitative Aussage zur vitalen Zellzahl getroffen werden konnte. Um eine spektroskopische Analyse im Schlauch durchzuführen, musste ein spektroskopisches Analysesystem aus mehreren Komponenten zusammengestellt und optimiert werden. Hierfür wurden eine Hochleistungslichtquelle, ein Kühlmodul, ein Spektroskopiemodul sowie ein Spektrometer mit Lichtleitern verbunden. Außerdem wurden Bandpassfilter und Kollimatorlinsen in den Strahlengang integriert. Der Fokus lag dabei auf einer hochsensitiven Fluoreszenzmessung zur Zellvitalitätsanalyse. Zusätzlich sollte das spektroskopische Analysesystem eine breite Anwendungsmöglichkeit bieten, sodass zukünftig auch Absorptionsspektren von chemischen Synthesen durchgeführt werden können. Abschließend wurde das optimierte Analysesystem mittels Kalibriergeraden charakterisiert. Im Anschluss wurde das spektroskopische Analysesystem in das tropfenbasierte Mikrofluidik-System implementiert. Im Zuge dessen wurden die Prozessschritte, die zur Durchführung eines alamarBlue®-Assays notwendig sind, etabliert. Darunter zählen die Generierung eines Konzentrationsgradienten, die Ermittlung der optimalen Parameter zur Farbstoffzudosierung sowie die Optimierung von Inkubation und Analysevorgang. Als letzter Schritt erfolgte die Charakterisierung des schlauchbasierten alamarBlue®-Assays und ein Vergleich mit etablierten Analysemethoden auf Basis der Mikrotiterplatten-Technologie.

Im Fachgebiet "Miniaturisierte Biotechnologie" wird mit großem Erfolg die Mikrofluidsegmenttechnik in Bezug auf die Miniaturisierung und Automatisierung der Dosis-Wirkungs-Untersuchung an Mikroorganismen auf unterschiedliche Wirksubstanzen eingesetzt. Das Ziel dieser Arbeit besteht in der Verbesserung eines Mikrofluidsystems durch den Einsatz eines neuen, chipbasierten Segmentgenerators (Lab-Disk-Modul C DG500) und eines Mikrodurchfluss-Impedanzsensors, sodass die Einzel- sowie Kombinationswirkung von Schwermetallen auf Bodenbakterien anhand der hochauflösenden Dosis-Wirkungs-Untersuchungen ermittelt werden können. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Schwermetallsalze Cu2+, Ni2+ und Co2+ auf verschiedene Streptomyces-Strains und Rhodococcus-Strains als Testbakterien untersucht, die jeweils aus Böden aus Altbergbauarealen in Thüringen isoliert wurden. Die gewählten Bodenisolate wurden aus Arealen entnommen, die möglicherweise eine erhöhte Schwermetall-Konzentration im Boden aufweisen und daher potentiell eine erhöhte Schwermetalltoleranz besitzen. Mit dem, in dieser Arbeit entwickelten, Mikrofluidsystem konnten hochaufgelöste Einzelwirkungs-Screenings an unterschiedlichen Bodenisolaten durchgeführt werden. Durch den Einsatz eines optischen und eines Impedanz-Sensors konnte Dosis-Wirkungs-Diagramme für die entsprechenden Schwermetallsalze erstellt und daraufhin analysiert werden. Neben den optischen Messparameter (Photometrie und Fluorimetrie) lieferte elektrische Impedanzmessung zusätzliche Informationen über das Wachstumsverhalten der Bodenisolate. Die Farbstoff-Verifikation zeigt, dass mit dem Lab-Disk-Modul C DG500 im Vergleich zu dem 7-Port-Manifold eine höhere Genauigkeit für zweidimensionale Segmenterzeugung erreichbar und somit besser für die Untersuchung der 2D-Dosis-Wirkungs-Screenings geeignet ist. Abschließend wurde ein 2D-Kombinationswirkungs-Screening von Cu2+ und Ni2+ auf Bodenisolate mit dem totvolumenarmen Lab-Disk-Modul C DG500 durchgeführt. Damit konnte eine hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen und die daraus resultierende additive Wirkung von Schwermetallsalzen auf Rhodococcus-Strains ermittelt werden. Aufgrund der Versuchsergebnisse wird deutlich, dass durch den Einsatz der beiden neuen Bauelemente in den angewendeten Mikrofluidsystemen die Charakterisierung des Wachstumsverhaltes der Bodenisolate Streptomyces und Rhodococcus verbessert werden kann. Dadurch wird eine Basis geschaffen, um fundierte Aussagen über die Schwermetall-Toleranz von Ökosystemen zu treffen. Schlagwörter: Mikrofluidik, Schwermetall, Streptomyces, Rhodococcus, Impedanz, Lab-Disk (Chip), Dosis-Wirkung-Beziehung

Biofilme spielen im Leben des Menschen eine entscheidende Rolle, da sie häufig eine gesundheitliche Gefährdung für den Menschen darstellen. Da die Biofilmbildung innerhalb von Stunden geschieht und deren Beseitigung später schwierig ist, soll die Adhäsion der Bakterien schnellstmöglich detektiert werden. Im Zuge dieser Arbeit wurde die Biofilmbildung mittels kontinuierlichem, nichtinvasivem impedimetrischem Monitoring aufgezeichnet und beobachtet. Um unterschiedliche Oberflächeneigenschaften zu erzielen, wurden diese mit drei verschiedenen Beschichtungen (PEI, PDADMAC, ConA) chemisch modifiziert. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass die physiochemische Veränderung der Oberfläche deutliche Auswirkungen auf die Biofilmdicke und den Besiedlungsgrad der jeweiligen Oberfläche hatte. Mittels Impedanzversuche konnte detektiert werden, dass die Biofilmbildung auf PDADMAC-beschichteten Elektroden am optimalsten war und die Biofilmdicke mit der Zeit zunahm. Auch konnte aufgrund der Impedanzspektroskopie gezeigt werden, dass PEI eine bakterizide Wirkung auf Bakterien hatte und eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten Biofilmen ermöglichte. Auf Grundlage von optischen Methoden, CLSM- und Weißlichtinterferometermessungen, war dies nicht möglich. Die Biofilmdicke wurde zusätzlich mit Hilfe des Weißlichtinterferometers und dem CLSM aufgenommen. Anschließend wurden die Messungen ins Verhältnis zu der jeweiligen relativen Änderung |Z| gesetzt. Hierdurch konnte eine Korrelation zwischen dem Ansteigen und Abfallen der Impedanzwerte und der Biofilmdicke nachgewiesen werden. Bei der Nutzung von PDAMAC sowie ConA wurde bei CLSM- und Weißlichtinterferometeraufnahmen ein höherer Besiedlungsgrad festgestellt als bei der Nutzung von PEI. Auch wurde bei den CLSM-Aufnahmen die bakterizide Wirkung von PEI bei direktem Kontakt mit den Bakterien ersichtlich. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit die Zugabe von Antibiotikum Auswirkungen auf einen bereits bestehenden Biofilm und einen sich bildenden Biofilm hatte. Sowohl impedimetrisch als auch bei CLSM- und Weißlichtinterferometermessungen konnte detektiert werden, dass die Biofilmentstehung dadurch nur gehemmt stattfand. Auch konnte der Einfluss von Antibiotika auf einen bereits bestehenden Biofilm gezeigt werden, da sich die Biofilmdicke und der Bedeckungsgrad reduzierten.