Optimierung des GSH-Chemoassays zur Analyse der Peptidreaktivität organischer Elektrophile mit der HPLC-MS/MS. - 100 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2014
Gegenstand dieser Arbeit ist es, den photometrischen GSH-Chemoassay nach Böhme et al zur Analyse von Peptidreaktivitäten organischer Elektrophiler mithilfe der HPLC-MS/MS zu optimieren. Dazu wurde zunächst Glutathion quantifiziert und fragmentiert und mit einer entwickelten LC-MS/MS-Methode kombiniert. Mit dieser Methode wurden für verschiedene GSH-Keton-Verhältnisse Adduktprofile aufgenommen und zu Erstellung von Strukturvorschlägen eine Fragmentierung der GSH-Keton-Addukte vorgenommen. Weiterhin konnten erfolgreich Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten mit der HPLC-MS/MS für die fünf untersuchten Ketone bestimmt werden.
Untersuchungen zur Extraktion und Detektion von Humanpathogenen in fluidischen Systemen. - 78 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2014
In den vergangenen Jahren kam es zu einem verstärkten Auftreten von Infektionskrankheiten, welche durch Legionella pneumophila (p.) oder einer der anderen einundzwanzig bekannten humanpathogenen Legionella Spezies verursacht wurden. In den Jahren zwischen 2005 und 2011 lag die durchschnittliche Anzahl dieser Infektionen insgesamt in Deutschland im mittleren dreistelligen Bereich mit einer zunehmenden Tendenz [SM12]. Diese Fälle verliefen mit einer Letalität von 4,3 bis 8,1 Prozent [SM12]. In der Europäischen Union (EU) stieg die Infektionsrate an Legionellosen in den Jahren 1993 bis 2008 von 4,1 Erkrankungen je einer Million Einwohner auf 11,8 [JR+10]. Dieser Umstand führte in der EU zum Überdenken des gängigen Standards. Die daraus resultierende Testpflicht für alle Warmwasseranlagen ab 400 Liter Speichervolumen gehört zu den weitreichendsten Änderungen der Trinkwasserverordnung in den vergangen Jahren. Um den daraus resultierenden Anforderungen zu entsprechen und einen immensen Kostenanstieg durch die stark gestiegene Anzahl der Beprobungen zu vermeiden, ist es notwendig, eine schnelle Aussage vor Ort zu einer möglichen Gesundheitsgefährdung durch Pathogene, zu ermöglichen. Die alleinige Bestimmung der Anzahl an Genomkopien in der Probe ist für die Trinkwasseranalytik und für die darauf aufbauende Sanierungsüberwachung jedoch nicht ausreichend. Nur eine Aussage über die Vermehrungsfähigkeit der Mikroorganismen ermöglicht endgültige Entscheidungen, ob ein Gesundheitsrisiko für die Nutzer der Hauswasserinstallation besteht. Heutzutage gängige Systeme, wie zum Beispiel auf Antigenen beruhende, sind nicht oder nur unzureichend in der Lage, lebende von toten Erregern zu unterscheiden und erreichen oftmals nicht die geforderte Nachweisgrenze [JFA+06, RLL+02]. Die Verfahren, welche die geforderte Nachweisgrenze realisieren können, sind im Regelfall Zellkulturverfahren. Diese sind aber langwierig und kostenintensiv [WBW01]. Es angestrebt, eine Schnellnachweismethode für die Detektion, Klassifizierung und Aktivitätsanalyse zu entwickeln. Für diesen Zweck ist eine molekularbiologische Methode wie eine Reverse Transkriptase (RT) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die in ein fluidisches System implementiert und als Kartusche ausgeführt werden kann, angedacht. Die gestellten Anforderungen an das neue System könnten durch die Kombination einer chipbasierten RT-PCR mit einem elektrochemischen Array umgesetzt werden. Im System integriert ist eine vorgeschaltete Separation mittels modifizierter Partikel (Beads) oder Systemoberflächen denkbar.
Charakterisierung und Optimierung eines miniaturisierten Testverfahrens und -systems zur Viruslastbestimmung am Modellsystem HI-Virus aus humanem Blutplasma. - 112 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2014
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Durchführung einer Machbarkeitsstudie für Nukleinsäureamplifikationstests (NAT) am Ort des Geschehens (Point-of-Care) anhand einer HI-Viruslastbestimmung aus humanem Blutplasma. Hintergrund ist die dezentrale Bestimmung der Viruslast aus 1 ml Blutplasma über eine Einwegkartuschen basierte Diagnostik-Plattform (Alere Q HIV ). Diese Einwegkartusche wurde von Alere Technologies GmbH entwickelt, um dem internationalen Standard für HIV-NAT gerecht zu werden. Ziel dieser Arbeit war sowohl die Charakterisierung und Optimierung der bestehenden Kartusche als auch die Durchführung eines kompletten Nukleinsäuretests innerhalb der Kartusche zu zeigen. In der Einwegkartusche wurden zwei Varianten zur Probeaufnahme integriert und charakterisiert, eine direkte Befüllung der Kartusche über eine Pipette und eine indirekte, automatisierte Befüllung aus einem zuvor zentrifugierten Blutentnahmeröhrchen. Die Steuerung hierfür wurde über eine skriptbasierte Software für die Diagnosestation programmiert und optimiert. Die Isolation der Ziel RNA erfolgte in der Einwegkartusche mittels eines druckluftgesteuerten, fluidischen Ablaufs. Zum Schutz der Druckluftwege in der Einwegkartusche wurde ein Membranbauteil entwickelt und untersucht, welches aus einer hydrophoben Membran aus Acryl-Copolymer auf Polyamid und einem Trägerring aus Polypropylen (PP) besteht. Im fluidischen Prozess wurden verschiedene Abläufe, insbesondere die thermische Lyse, an das Flüssigkeitsvolumen angepasst. Über eine Echtzeit Amplifikationsreaktion konnte anschließend ein Prinzipnachweis der Quantifizierung über eine kompetitive Wechselwirkung von Reportermolekülen mit auf einem Array immobilisierten Sonden (CMA) erbracht werden. Dafür wurden die Ergebnisse von 30 Einwegkartuschen ausgewertet. Mit dieser Arbeit konnte die Machbarkeit mittels einer Einwegkartusche die HI-Viruslast in 1 ml Blutplasma zu quantifizieren, demonstriert werden. Bei der Optimierung zeigte sich, dass es sinnvoll ist für jede Probenaufnahme eine separate, spezifische Einwegkartusche zu verwenden.
Etablierung einer Selektionsplattform im 96-Well-Format zur Erzeugung von Saccharomyces cerevisiae-Mutanten mittels EMS und MNNG mit anschließender Charakterisierung hinsichtlich Glutathion und oxidativem Stress. - 108 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2014
Dieser Masterarbeit beschäftigte sich mit der Erzeugung, Selektion und Charakterisierung hinsichtlich des Wachstumsverhaltens, intrazellulären Glutathion sowie dem oxidativem Stress-Level von Saccharomyces cerevisiae-Mutanten. Der ausgewählte Wirts-Stamm wurde mit Hilfe der chemischen Agenzien MNNG und EMS mutiert und über verschiedene Selektionsdrücke in verschiedenen Konzentrationsbereichen selektiert. Die anschließende Charakterisierung der genannten Parameter erfolgte im 96-Well-Format, um eine möglichst große Anzahl an Mutanten untersuchen zu können. Mit den erfolgten Maßnahmen konnten Mutanten erzeugt werde, die bei vergleichbarem Wachstumsverhalten (BTS-Vergleich nach 72 h: Wirts-Stamm: 14,24 g/l; erzeugte Mutante Cerulenin III E-5: 15,66 g/l) eine gesteigerte GSH-Konzentration (relative GSH-Konzentration nach 72 h: Wirts-Stamm: 0,467; Mutante Cerulenin III E-5: 0,525) im Vergleich zum Wirts-Stamm aufwiesen. Dies entsprach einer Steigerung der relativen GSH-Konzentration der Mutante Cerulenin III E-5 um 12,4 % im Vergleich zum Wirt-Stamm und bedeutete somit die höchste erreichte Steigerung. Durch die ermittelten Korrelationskoeffizienten von 0,97 bzw. 0,95 nach 48 h bzw. 72 h konnte im Rahmen dieser Arbeit eine signifikante Korrelation zwischen der intrazellulären GSH-Konzentration und dem oxidativen Stress-Level der Mutanten gezeigt werden.
Entwicklung eines kompakten Messaufbaus und -verfahrens für die Ermittlung von Dosis/Wirkungs-Funktionen an schwermetall-toleranten Bakterien in Mikrofluidsegmenten mittels SERS-Charakterisierung. - 140 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2013
In der vorliegenden Masterarbeit wurden nach Validierung des vorhandenen Raman-Kompaktaufbaus der Firma Raman Systems Inc. Änderungen und Modifikationen vorgenommen, um diesen für Raman- und SERS-Messungen im segmentierten Fluss zu optimieren. Ziel sollte es sein, von Mikroorganismen gebildete Sekundärmetabolite, wie z.B. Antibiotika, aufgrund von effektorspezifischen Konzentrationsänderung im SERS-Spektrum zu detektieren und im Idealfall zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden für den SERS-Effekt benötigte Polyacrylamid-Sensorpartikel in verschiedenen Größen hergestellt und sowohl innen als auch außen mit Silber verstärkt. Es wurde eine ideale Silberkonzentration ermittelt, welche den SERS-Verstärkungseffekt maximiert und somit bestmögliche Signale liefert. Es konnten unter anderem SERS-Spektren von Modellanalyten, Zellen, sowie Antibiotika aufgenommen und die minimal mit diesem Aufbau möglichen Detektionsschwellen ermittelt werden. Nach mehreren Optimierungen des Kompaktaufbaus war es anschließend möglich, Raman-Signale im segmentierten Fluss aufzunehmen. Während Testmessungen die problemlose Trennung von Analyt- und Trägerphase sowie die Durchführbarkeit eines Konzentrationsgradienten im segmentierten Fluss aufzeigten, war die Applizierung der silberverstärkten Sensorpartikel in den mikrofluidischen Aufbau nicht möglich, da aufgrund von Sedimentation und Aggregation der Partikel innerhalb der Spritze sowie im Schlauchsystem selbst, keine reproduzierbare Möglichkeit der Messung von SERS-Spektren offenlegte. Weiterhin wurden die Anforderungen an ein neues Raman-Kompaktsystem aufgezeigt und mit aktuell verfügbaren Kompaktsystemen verglichen, wodurch die hier durchgeführten Messergebnisse verbessert und eventuell einige der aufgetretenen Probleme gelöst werden könnten. Alle der hier aufgezeigten und durchgeführten Verbesserungen und Modifikationen lassen sich problemlos auf ein neues Raman-Kompaktsystem übertragen und sorgen damit für eine allgemeine Optimierungsmöglichkeit von handelsüblichen Raman-Kompaktgeräten, um diese für spezielle Aufgaben im mikrofluidischem Forschungsbereich zu etablieren.
Design and fabrication of a microfluidic platform for raman spectroscopy based cell diagnostics. - 91 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2013
Lab-on-a-Chip Technologien haben aufgrund ihres Potentials für schnelle und kontrollierte Handhabung kleiner Probenmengen ein großes wissenschaftliches Interesse erlangt. Speziell für Anwendungen in der medizinischen Diagnostik bietet diese Technologie vielversprechende Möglichkeiten. Verschiedenste Strategien wurden entwickelt um Flüssigkeiten im mikrofluidischen System zu transportieren. Dazu gehören Druck betriebene Techniken, Elektroosmose oder auch Methoden die Kapillarkräfte nutzen. Eine weitere Technik bieten zentrifugal betriebene Plattformen (Lab-on-a-disc). In dem vorliegenden Bericht werden zwei Lab-on-a-disc Strategien vorgestellt, um potentielle pathogene Mikroorganismen an definierten Stellen im Chip einzufangen und damit für Raman Messungen zugänglich zu machen. Die erste Strategie nutzt einen Array bestehend aus V-förmigen Mikrostrukturen, in denen die Bakterien aus wässriger Lösung angereichert werden. Bei der zweiten Methode wurden die Bakterien auf einer Filtermembran aufgefangen. Auf diese Membran wurde zusätzlich eine Gitterstruktur aus einem SU-8 Polymer aufgebracht, so dass die Bakterien an bestimmten, wohl definierten Stellen aufkonzentriert wurden. Durch die Verwendung von Glasfenstern über der Fangstruktur, konnten sowohl in den V-förmigen Mikrostrukturen, als auch auf den Membranen mit Gitterstruktur die gefangenen Bakterien mittels Raman-Spektroskopie charakterisiert werden. Außerdem ermöglichen beide Strategien zusätzliche Inkubationsschritte mit Antibiotika und Waschschritte, ohne die eingefangenen Mikroorganismen zu verlieren.
Automatisierung magnetpartikelbasierter Immunoassays auf zentrifugal-mikrofluidischem Lab-on-a-Chip System. - 115 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2013
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Automatisierung magnetpartikelbasierter Immunoassays zum Nachweis von Sepsis bei Neugeborenen auf einem zentrifugal-mikrofluidischen Lab-on-a-Chip System. Ausgangspunkt war ein bestehender magnetpartikelbasierter CRP Assay, der manuell auf einer 96-Wells-Mikrotiterplatte etabliert wurde. Zur Realisierung der Automatisierung wurde in den Vorarbeiten am IMTEK bereits eine Foliendisk (ELISA-Disk I) hergestellt, auf der jedoch noch kein CRP Assay experimentell erprobt wurde. Auf der Foliendisk können sämtliche Immunoreagenzien, sowie die Probe einpipettiert und inkubiert werden. Mit dem Prozessierungsgerät LabDisk Player kann die Durchführung eines magnetpartikelbasierten ELISAs auf der Foliendisk automatisiert werden. In den Vorarbeiten gab es zwei wesentliche Probleme auf der ELISA-Disk I. Ein Problem war die Kreuzkontamination zwischen den Kammern. Ein weiteres Problem war der Beadtransport. Die Effizienz des Beadtransports über einen Durchlauf von mehreren Kammern zu Beginn der Arbeit war fast 0%. Mit dem Ziel einer zuverlässigen mikrofluidischen Funktionsweise und der Optimierung des Beadtransports wurden in dieser Arbeit zwei Disklayouts (ELISA-Disk II und one step ELISA-Disk) mit geänderten Strukturen zur Automatisierung des CRP-Assays entwickelt. Bei der ELISA-Disk II und der one step ELISA-Disk wurden zwei Pinning-Kanten im Luftspalt zwischen den Kammern erstellt, um die Kreuzkontamination zu vermeiden. Die Optimierung des Beadtransports erfolgt durch Beschichtung der Disk und Erhöhung der Beadmenge. Auf der mit Blockpuffer beschichteten ELISA-Disk II erreicht die Transporteffizienz 90% über mehreren Kammern mit 2 myl Dynabeads® M-280 und 8 myl Dynabeads® M-450. Durch Entwicklung eines one step ELISAs konnten die Assayschritte reduziert und die Ablaufzeit deutlich verkürzt werden. In dieser Arbeit wurde ein automatisierter CRP Immunoassay im pathophysiologischen Konzentrationsbereich (0,33 - 81 ng/ml) von Neugeborenensepsis auf einer zentrifugal-mikrofluidischen LabDisk etabliert. Aktuell können auf einer one step ELISA-Disk drei Proben parallel untersucht werden. Da zum Zeitpunkt der Arbeit im LabDisk Player noch keine Absorptionsmessung zur Verfügung stand, wurden nach der Prozessierung die Partikel mit Waschpuffer aus der Disk in die Mikrotiterplatte überführt, wo die enzymatische Reaktion und Detektion stattfindet. Die Prozessierung einer Probe erfolgt binnen 20 Minuten. Die gesamte Ablaufzeit für drei Proben auf einer Disk beträgt 40 Minuten. Es bleibt zu zeigen, dass die Absorptionsmessung auf dem LabDisk Player umgesetzt werden kann. Weiter sollten noch weitere magnetische Partikel alternativer Hersteller getestet werden, um den Beadtransport auf 100% zu optimieren.
Aufbau und Optimierung einer kontinuierlichen mikrofluidischen Durchflusssynthese von Silberseedpartikeln zur Generierung anisotroper Silbernanoprismen für die Bioanalytik. - 86 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2013
Die Arbeit zielt auf die Umsetzung der klassischen Batchmethode zur kontinuierlichen mikrofluidischen Synthese von Silberprismen. Dabei konnte ein fluidisches System etabliert werden, welches unter den Vorteilen der Mikroreaktionstechnik die Qualität, die Ausbeute und die Prozessstabilität der Partikelherstellung gewährleistet und sogar verbessert. Die entstandenen Nanopartikel dienen als Grundlage für bioanalytische Nachweisverfahren und wurden mit konventionellen, im Batch hergestellten Partikeln verglichen um den Einflus der Synthesemethode festzustellen.
Entwicklung und Charakterisierung eines neuartigen Aktuatorprinzips zur aktiven Tropfenmanipulation über elektrische Felder für die digitale Mikrofluidik. - 127 S. Ilmenau : Techn. Univ., Bachelor-Arbeit, 2013
Im Zuge zunehmender Miniaturisierung in nahezu allen Bereichen von Wissenschaft und Technik ist es ein wichtiges Ziel der Mikrosystemtechnik, ein möglichst leistungsfähiges und vielseitig einsetzbares Chiplabor zu entwickeln. Hier ist zur Realisierung voneinander abgegrenzter Mikroreaktionsräume die tropfenbasierte Mikrofluidik besonders vielversprechend. Für automatisierte Vielparameteranalysen und -synthesen auf Chipebene sind Techniken erforderlich, die es erlauben, Flüssigkeitssegmente zu ihrem Bestimmungsort zu transportieren, sie mit anderen Kompartimenten zu vereinigen oder größere Segmente zu zerteilen. Ganz besonders wichtig aber ist die Möglichkeit einer gezielten Ansteuerung einzelner Segmente, die z.B. ein Sortieren der Reaktionsräume nach beliebigen Kriterien möglich macht. In dieser Arbeit wurde zunächst ein System entwickelt, dass eine schnelle und zuverlässige Aktuation einzelner Segmente innerhalb eines Mikrofluidikchips mit integrierten Elektroden über elektrische Felder ermöglicht. Die Segmente werden dazu in einem Mikrokanal zunächst optisch detektiert. Es wurde eine Software entwickelt, die das optische Signal in Echtzeit auswertet und über die Steuerung eines Hochspannungsmoduls eine Rückkopplung auf die Segmente erlaubt. Über Änderungen des elektrischen Feldes und seiner Polarität können die Segmente an einer Y-Kanalkreuzung reproduzierbar in den gewünschten Kanal gelenkt werden. Nach einer Optimierung der für die Aktuation günstigen Parameter konnte gezeigt werden, dass über dieses System Information in der Anordnung von Segmenten gespeichert werden kann. Mit Hilfe weiterer Experimente wurde der Schaltmechanismus besser charakterisiert. Es kann jetzt ausgeschlossen werden, dass rein elektrostatische, dielektrophoretische oder durch Elektrobenetzung hervorgerufene Kräfte für den Schalteffekt verantwortlich sind. Ein Modellexperiment mit frei fallenden Segmenten ermöglichte die Messung charakteristischer Relaxationszeiten und weiterer für die Aktuation wichtiger Parameter. Unterstützt durch Simulationen des elektrischen Feldes wird ein Modell vorgeschlagen, dass einige der beobachteten Effekte erklären kann. Es beschreibt die Tropfenbewegung über die temporäre Induktion einer Nettoladung an der Tropfengrenzfläche und anschließende elektrostatische Ablenkung. Zur Klärung aller Effekte, sind weitere Untersuchungen nötig.
Untersuchung des Einflusses von Leukozyten bei der Quantifizierung tumorassoziierter Transkripte nach Separation von zirkulierenden Tumorzellen. - 75 S. Ilmenau : Techn. Univ., Masterarbeit, 2012
Zirkulierende Tumorzellen bekommen immer mehr eine größere klinische Relevanz in der Prognose des Mamakarzinoms. Mit Hilfe der Kombination von immunmagnetischer Anreicherung und Multiplex-RT-PCR können CTC`s aus Vollblut isoliert und tumorspezifische Transkripte quantifiziert werden. Problematisch bei der Separation der CTC`s ist die Mitisolierung von kernhaltigen Blutzellen. Durch eine Charakterisierung und Quantifizierung der isolierten kernhaltigen Blutzellen soll der Einfluss dieser Zellen auf die Quantifizierung der tumorassoziierenden Transkripte untersucht werden.