Etablierung einer Fluoreszenz basierten Zellvitalitätsanalyse für tropfenbasierte mikrofluidische Anwendung. - Ilmenau. - 93 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2020
Die tropfenbasierte Mikrofluidik ermöglicht die Isolierung und die Manipulation von einzelnen Zellen und Reagenzien innerhalb von dispergierten Kompartimenten. Diese moderne Technologie bietet umfangreiche Einsatzmöglichkeiten in den Bereichen der Chemie, der Biologie und der Medizin. Im Rahmen der Masterarbeit wurde die Funktionalität eines tropfenbasierten Mikrofluidik-Systems für die Etablierung eines alamarBlue®-Assays untersucht. Es wurden in einem tropfenbasierten Mikrofluidik-System Kompartimente mit unterschied-licher Verdünnung einer U-87MG Zellsuspension erzeugt. Darüber hinaus wurde den Tropfen ein definiertes Volumen des alamarBlue®-Farbstoffs zugegeben. Die Zugabe erfolgte mit einem mikrofluidischen Zudosiermodul. Durch die metabolische Aktivität der vitalen U-87MG Zellen wurde die nichtfluoreszierende Form des alamarBlue®-Farbstoffs, das Resazurin, in die fluoreszierende Form Resorufin umgewandelt. Die Vitalität der Zellen im Tropfen ist hierbei proportional zum Fluoreszenzsignal des einzelnen Tropfens. Für eine quantitative Fluoreszenzmessung von Tropfen in einem Schlauch, wurde ein Analysemodul bestehend aus einer Lichtquelle, einem Fluidikmodul und einer Detektionseinheit (Spektrometer oder PMT), aufgebaut und optimiert. Als Lichtquelle diente eine Laserdiode (525 nm) die über Lichtleiter mit dem speziell für tropfenbasierte Anwendungen entwickelten Analysemodul gekoppelt wurde. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte entweder mit einem Spektrometer oder mit einem Photomultiplier (PMT). Der Fokus der Untersuchungen lag auf der Steigerung der Sensitivität. Desweitern wurden im Rahmen der Arbeit alle Komponenten des tropfenbasierten Mikrofluidik-Systems und des Analysemoduls charakterisiert und optimiert. Die Validierung des Mikrofluidik-Systems basierte auf der Ermittlung der Zellvitalität mittels alamarBlue®-Assay. Mit Hilfe der Vitalitätsanalyse wurde z.B. ermittelt, ob ein zuvor erzeugter Zellgradienten effizient und zuverlässig mit dem tropfenbasierten Mikrofluidik-System generiert werden kann. Letztendlich wurden die Messergebnisse, die mit dem Spektrometer und dem Photomutliplier erfasst wurden gegenübergestellt und diskutiert.
Synthese C60-funktionalisierter Zinkkomplexe. - Ilmenau. - 40 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2020
Ziel der vorliegenden Bachelorarbeit war es, ein wasserlösliches Konjugat, bestehend aus einem Zinkkomplex und einem C60-Fulleren, zu synthetisieren. Dieses Konjugat wird extern auf potentielle pharmakologische Eigenschaften getestet. Über eine Einhorn-Reaktion gelang es, die säurefunktionalisierte C60-Verbindung Phenyl-C61-Buttersäurechlorid mit dem Zinkkomplex [ZnCl2(4-{(E)-[(pyridin-2-yl)methyliden]amino}phenol)] über dessen phenolische Gruppe zu koppeln. Die neuartige Verbindung löst sich unter geringfügiger Zugabe von DMSO in Wasser und ist so grundsätzlich für den Einsatz in biologischen Systemen geeignet.
Entwicklung und Optimierung einer Methode zur HPLC-gekoppelten Size-Exclusion Chromatographie zur Untersuchung von Antikörperaggregaten sowie mit Peroxidase markierten Antikörpern. - Ilmenau. - 51 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2020
Ziel der Bachelorarbeit war es eine möglichst universell anwendbare Methode zur Qualitätskontrolle von Antikörpern und auf antikörperbasierenden Produkten, insbesondere perxodasemarkierte Antikörper, mittels HPLC-gekoppelter Größenausschlusschromatographie zu entwickeln. Hierzu wurden zunächst allgemeine Versuchsparameter, wie z.B. Laufpufferzusammensetzung und Flussgeschwindigkeit, untersucht. Anwendung fand die entwickelte Methode letzten Endes bei der Überprüfung, ob die Peroxidasemarkierung eines a-MRP14 Antikörpers vollständig abgelaufen ist, was durch Spiken einer Lösung, welche peroxidasemarkierte Antikörper enthält, mit unmarkiertem Antikörper simuliert wurde. Hier zeigt sich ein durchaus geeignetes Anwendungsgebiet der Methode, was sich anhand der geringen nachweisbaren Mengen von unmarkiertem Antikörper zeigen lässt. Ein weiteres Anwendungsgebiet war die Untersuchung der Stabilität von FP72 Antikörpern in unterschiedlichen Matrizes, wobei, aller Wahrscheinlichkeit nach, aufgrund der bereits stark aggregierten Antikörper Ergebnisse erzielt wurden, welche gängigen Theorien, zumindest zum Teil, widersprechen.
Synthese amphiphiler, polymerisierbarer Thiazolkörper. - Ilmenau. - 38 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2019
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese eines amphiphilen, polymerisierbaren 4-Hydroxythiazol basierenden Moleküls. Ausgehend von Benzonitrilen, welche paraständig mit hydrophoben Subeinheiten, Alkyl- und Alkoxygruppen, funktionalisiert wurden, gelang der Aufbau des Thiazolgrundkörpers. Die Alkylfunktionalisierung wurde dabei mittels Suzuki-Miyaura-Kupplung, die Alkoxyfunktion wurde via Willisamson Veretherung eingeführt. Die Heterocyclensynthese folgte der Hantzschen Route und realisierte die direkte Erzeugung eines 4-Hydroxy-5-ethylcarboxylat funktionalisierten Thiazols. Zur Etablierung des amphiphilen Charakters wurde die phenolartige 4-Hydroxygruppe des Thiazoles, ebenfalls über Williamsonscher Veretherung in einen hydrophilen Triethylenglykolmonomethylether überführt. Als letzter Schritt konnte die Reduktion der Estergruppe mittels Lithiumaluminiumhydrid gezeigt werden. Nach zukünftiger Umsetzung mit Methacrylsäurechlorid können so Systeme zugänglich sein, welche zum Aufbau von Langmuir-Blodgett-Schichten verwendet werden können.
Selektive Detektion von Hepatozyten und Sinusoidalen Leberendothelzellen in einem Zellsheetlayersystem durch Antikörper-basierte Immunfluoreszenz. - Ilmenau : Universitätsbibliothek. - 1 Online-Ressource (IV, 36 Seiten)
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2019
Humane primäre Hepatozyten werden häufig zur Untersuchung von Arzneimitteltoxizitäten, Arzneimittel-Clearance und Arzneimittel-Wechselwirkungen verwendet. Aufgrund der schnellen Dedifferenzierung der Zellen in zweidimensionalen Kulturen geht der Leberphänotyp und die Leberfunktion verloren und eine langfristige Kultivierung ist nicht möglich. Aus diesem Grund werden häufig 3D- Zellkultursysteme verwendet, die die in vivo Leberphysiologie besser imitieren können. In der Arbeitsgruppe wurde ein Zellsheetlayersystem (CSL) entwickelt, welche Leberläppchen nachahmen und mit Hepatozyten und sinuosidalen Leberendothelzellen besiedelt werden können. Die Herstellung erfolgt durch die 3D-[my]-contact-printing-Methode. Das Kultivieren von Zellen in diesen dreidimensionalen Strukturen kann zu phänotypischen und funktionellen Verbesserungen bei den kokultivierten Zelltypen führen. Das Ziel der vorliegenden Bachelorarbeit war die Entwicklung einer Antikörper-basierten Immunfluoreszenzdetektionsmethode, durch die Hepatozyten und sinuosidale Leberendothelzellen (LSECs) auf einem Zell-Sheet-Layer-System (cell-sheet-layer, CSL) durch Farbstoff-markierte Antikörper und Laserscanningmikroskopie selektiv detektiert werden können. Dies dient zur besseren Charakterisierung des Zellsheetlayer-Kokultursystems. Zu diesem Zweck wurden primäre upcyte® Hepatozyten (pHeps) und primäre upcyte® LSECs verwendet, welche aufgrund gentechnischer Modifikationen länger proliferieren können. Mit der 3D-[my]-contact-printing-Methode wurden Zellsheetlayer hergestellt. Verschiedene Antikörper (AK)-Kombinationen wurden getestet und die Immunfluoreszenzdetektionsmethode konnte erfolgreich mit einem monoklonalem anti-Albumin-AK zur Detektion der Hepatozyten sowie einem monoklonalem anti CD31-AK zur Detektion der LSECs in einer 2D-Kokultur etabliert werden. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die selektive Detektion der Hepatozyten und LSECs mit folgenden AK-Kombinationen nicht möglich war: polyklonaler anti Albumin AK (Heps)/ monoklonaler anti CD31-AK (LSECs) und monoklonaler anti AAT-1-AK (Heps)/ monoklonaler anti CD31-AK (LSECs). Der Grund hierfür waren jeweils unspezifische Bindungen der AK an beide Zelltypen. Die Ergebnisse zeigen, dass bei der selektiven Detektion von verschiedenen Zelltypen in einem Kokultursystem auf Unspezifität der verwendeten AK geachtet werden muss und die spezifischen Antigene sorgfältig ausgewählt werden müssen.
https://doi.org/10.22032/dbt.40534
Einfluss einer wiederholten Acetaminophen-Applikation auf humane upcyte® Hepatozyten in einer 2D-Langzeit-Zellkultur. - Ilmenau. - 39 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2019
Die toxische Wirkung von Acetaminophen basiert auf dem Metaboliten N-Acetyl-p-benzochinonimin, welcher bei der Oxidation von Acetaminophen in einer Phase-I-Reaktion über das CYP450-Enzymsystem gebildet wird. Das Ziel der Arbeit bestand darin, die Auswirkungen wiederholter Acetaminophen-Applikationen auf humane upcyte® Hepatozyten über einen Zeitraum von 31 Tagen aufzuzeigen. Insbesondere sollten die Effekte physiologisch relevanter Acetaminophen-Konzentrationen (50 [my]M, 100 [my]M, 250 [my]M) mit höheren potenziell toxischen Acetaminophen-Konzentrationen (2 mM, 5 mM) auf humane upcyte® Zellen verglichen werden. Hierzu wurde täglich die Zellfunktion in Hinblick auf die Albumin-Sekretion und die LDH-Sekretion als Maß für die Acetaminophen induzierte Hepatotoxizität aus den Medium-Überständen bestimmt. Zudem sollte die Eignung der upcyte® Hepatozyten für Toxizitätsstudien dieser Art getestet werden. Durch die wiederholten Applikationen physiologisch relevanter Acetaminophen-Konzentrationen auf die upcyte® Hepatozyten konnte über den Inkubationszeitraum eine Steigerung der Zellfunktionalität in Hinblick auf die Albumin-Sekretion gezeigt werden. Im Gegensatz dazu führen hohe Konzentrationen (2 mM und 5 mM) zu einer starken Einschränkung der Zellfunktionalität. Entstandene Zellschädigungen durch die APAP-Applikationen zeigten sich im LDH-Assay reversibel. Die verwendeten upcyte® Hepatozyten wiesen eine lange Lebensdauer auf, wodurch die Langzeitkultur ermöglicht wurde.
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2019
Strahlentherapie zur Behandlung von Hirntumoren bei Kindern führt oft zu Hirnverletzungen, die Langzeitnebenwirkungen wie die Minderung der Neurokognition verursachen können. Zum Verständnis des Mechanismus der Neurotoxizität und zum Vergleich der Effekte verschiedener Therapiemethoden ist es notwendig ein Brain Radiation Assay zu etablieren. Engineered cerebral organoids (enCORs) eignen sich als in vitro Modelle, da sie hochkomplexe Strukturen und diverse Hirnregionen aufweisen. Allerdings, weisen enCORs hinsichtlich ihrer Form und Größe Heterogenität auf. In dieser Studie wurden Scaffolds aus biokompatiblen Polymeren hergestellt und/oder hinsichtlich der Kultivierungseigenschaften der enCORs untersucht. Die Scaffolds wurden verwendet um enCORs aus der humanen embryonalen Stammzelllinie H9 zu generieren. Der zweite Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der enCORs bestand aus der Vereinheitlichung von embryoid bodies durch Kultivierung auf elektrogesponnenem Poly-[Epsilon]-caprolacton Meshs, welche durch Liverani bereitgestellt wurden. Die generierten enCORs wurden hinsichtlich ihrer Morphologie, Größe und Genexpression untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die enCORs, welche etablierte Protokolle generiert wurden, eine geringere Heterogenität aufwiesen im Vergleich zu den enCORs, die in den betrachteten Scaffolds generiert wurden. Die Kultivierung der H9 Zellen auf dem elektrogesponnem Poly-[Epsilon]-caprolacton Mesh führte nicht zur Bildung von embryoid bodies.
Design und Herstellung von DNA-Modulen als Bausteine zur kombinatorischen Synthese einer Textmitteilung auf Nukleinsäureebene. - Ilmenau. - 99 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2019
Ziel der vorliegenden Bachelorarbeit ist es, ein Konzept zum Designen von einzelsträngigen DNA-Oligomeren zu entwickeln, um aus diesen nach einigen wenigen Arbeitsschritten Texte in einer Abfolge von DNA-Basen eines DNA-Doppelstrangs zu codieren. Diese DNA-Konstrukte sollen als funktionale Markierung an Gegenständen aller Art angebracht werden und produktspezifische Informationen codieren. Zur Überprüfung der Umsetzbarkeit wurde ein exemplarischer Satz an Oligomeren designt und verschiedene Versuche zur Synthese durchgeführt. Das gewünschte Produkt konnte nicht synthetisiert werden, da die Oligomere aufgrund ihres Designs über längere Zeit instabil wurden und so hauptsächlich unerwünschte Nebenprodukte und Abbauprodukte auftraten.
Fibronektin- und Tenascin-C-Expression bei Fn-ED-A-Defizienz im Maus knockout-Modell. - Ilmenau. - 55 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2019
Die pulmonale Hypertonie (PH) ist ein klinisch und ätiologisch heterogenes Krankheitsbild, welches durch einen pulmonalarteriellen Druck von ≥ 25 mmHg definiert wird. Während der Progression kommt es zum Umbau der pulmonalvaskulären und myokardialen Gefäßstrukturen. Vor diesem Hintergrund sollte in einem Mausmodell der Einfluss von ED-A+-Fn auf die Progression der pulmonalen Hypertonie untersucht werden. Als Versuchsmodell wurde die PH mittels Monocrotalin in EDA-knockout und C57BL/6 Mäusen induziert. Im Anschluss sollte mittels histologischer, immunhistochemischer und molekularbiologsicher Analysen die Reexpression der onkofetalen Splicevariaten ED-A+-Fn und B+-TnC sowie zusätzlich von ASMA, COL3A1 und CD31 als Marker des pulmonalvaskulären und myokardialen Remodellings durchgeführt werden. Die MCT-induzierten Tiere zeigten einen erhöhter RVPsys und gesundheitliche Beeinträchtigung gegenüber den Kontrollen. Diese Folgeerscheinungen aufgrund der PH zeigten sich auch in einer ausgeprägten Schädigung in der Lunge. Zwischen den beiden MCT-Gruppen konnten Unterschiede in der Progression der Krankheit festgestellt werden, da alle Befunde in den C57BL/6 erkrankten Tieren schwerwiegender ausgeprägt waren als in den EDA-knockout Mäusen. In der durchgeführten Immunhistochemie konnte die Reexpression der onkofetalen Splicevarianten ED-A+-Fn und B+-TnC in den in den MCT-induzierten C57BL/6 Mäusen aufgezeigt werden. ED-A+-Fn dagegen konnte in keinem knockout-Tier nachgewiesen werden, was für das erfolgreiche Ausschalten des ED-A+-Fn Gens spricht. Für ASMA und COL3A1 konnte im Vergleich zwischen den Kontrollen und den MCT-induzierten Tieren eine gesteigerte Expression im Myokard der erkrankten Tiere nachgewiesen werden, wobei generell mehr Antigendeposition in den C57BL/6 als den EDA-knockout Mäusen vorlag. CD31 konnte in den erkrankten Tieren im Gegensatz zu den Kontrollen detektiert werden. Ein Unterschied zwischen den beiden MCT-induzierten Gruppen konnte nicht festgestellt werden. Die Isolation von RNA, aber auch DNA und Protein aus einer sehr kleinen Gewebeprobe konnte in qualitativer und quantitativ ausreichender Menge erfolgreich durchgeführt werden, so dass diese Methode für nachfolgende Versuche im Labor für mögliche Genexpressionsana-lysen angewandt werden kann. Die aus dieser Arbeit gewonnene Erkenntnis, dass das Fehlen von ED-A+-Fn die Ausbildung und gegebenenfalls auch die Progression der PH vermindert, spricht für eine wesentliche Rolle des ECM-Moleküls in der Pathologie der Erkrankung .Es ist zu erwarten, dass das Tiermodell der MCT-induzierten EDA-knockout Maus einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Pathologie der Krankheit leistet sowie die Basis für neue Therapieoptionen bietet.
Design, synthesis and evaluation of photoswitching properties of homologous dimeric Donor acceptor Stenhouse adducts. - Ilmenau. - 41 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2019
Das Donor-Acceptor-Stenhouse-Adduct (DASA), eine neue Klasse von photochromen Molekülen, die sowohl ihre Farbe als auch ihre physikalischen Eigenschaften wie Polarität und Löslichkeit bei Einwirkung von sichtbarem Licht verändern können, hat in letzter Zeit immer mehr Aufmerksamkeit auf die Entwicklung intelligenter Materialien und Medikamente gelenkt. Bisher werden fast alle Arten von DASA-Derivaten durch Ringöffnungsreaktion mit aktiviertem Furan nur auf einer Seite des DASA-Vorläufers hergestellt. In der vorliegenden Arbeit wird die Synthetische Methode zur Herstellung eines doppelt aktivierten Furankerns für die Durchführung einer Doppelseitigen Ringöffnungsreaktion mit Donor Aminen und zur Herstellung eines dimeren Donor-akzeptor-Stenhouse-Adducts entwickelt. Basierend auf der Standardmethode zur Synthese des Alkin-funktionalisierten DASA-Vorläufers und der Kupfer(I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition(CuAAC) wurden zwei Synthesestrategien entwickelt, um die Synthese des dimeren DASA-Vorläufers zu realisieren. Das resultierende Molekül wurde unter Verwendung von analytischen Standardtechniken gereinigt und vollständig charakterisiert. Dieser dimere DASA-Vorläufer zeigte die Fähigkeit, mit Donor Aminen zu reagieren, und führte wie alle DASA-Derivate einen Farbwechsel sowie eine photoschaltbare Eigenschaft unter Bestrahlung mit sichtbarem Licht durch. Außerdem, es werden in dieser Arbeit auch dimere DASA-Vorläufer mit unterschiedlichen Längen von Linkeralkylketten synthetisiert. Das Ergebnis dieser Studie bietet eine neue synthetische Route der neuartigen Derivate von DASA.