Nachweis der hepatozytären CYP3A4-Expression und -Induktion in einem Langzeit-Kokulturmodell der Leber. - Ilmenau. - 46 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2018
Die Leber hat einen großen Aufgabenbereich im menschlichen Körper. Zu ihren wichtigsten Aufgaben gehören die Entgiftung und der Abbau von Xenobiotika. Ein großer Teil dieser Stoffe wird durch das Protein CYP3A4, eine Monooxygenase aus der Familie der Cytochrome P450, verstoffwechselt. Diese Stoffe können jedoch auch induzierend oder inhibierend auf den Proteinhaushalt wirken, wodurch es zu Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen Medikamenten kommen kann. Das Ziel der Arbeit bestand darin, unterschiedliche Kulturmodelle in ihrer Proteinexpression und -induktion zu untersuchen und zu vergleichen. Das dabei betrachtete Protein ist CYP3A4 und die betrachteten Modelle sind ein klassisches 2-D-Monolayermodell von Hepatozyten, eine 3-D-Kultur von Hepatozyten und eine Kokultur aus Hepatozyten und lebersinusoidalen Endothelzellen. Hierbei waren sowohl die Hepatozyten als auch die lebersinusoidalen Endothelzellen primäre upcyte®-Zellen. Die Kultivierungsmethode hatte einen großen Einfluss auf die Proteinexpression und -induktion, so konnten in der 3-D-Kultur und der Kokultur ein deutlicher Anstieg der Proteinmenge sowohl in den basalen, als auch in den induzierten Kulturen nachgewiesen werden. Weiterhin ergaben die Messungen, dass die Kokultur keine weitere Steigerung der untersuchten Parameter gegenüber der 3-D-Monokultur zeigte, wodurch sich das 3-D-Modell von Hepatozyten als beste Basis für die Untersuchungen von Wirkstoffinteraktionen eignet
Elektrokatalytische Umsetzung von CO2 an modifizierten stickstoffdotierten Multiwalled Carbon Nanotubes. - Ilmenau. - 94 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2018
Die direkte elektrokatalytische Reduktion von CO2 zu Kohlenwasserstoen stellt eine vielversprechende Methode dar, mit welcher neben der Senkung des Kohlendioxidausstoßes auch die Herstellung von Grundchemikalien bzw. Energieträgern möglich ist. Um diese Methode auch wirtschaftlich ezient betreiben zu können, sind Verbesserung des Wirkungsgrades sowie der Selektivität zu bestimmten Kohlenwasserstoen nötig. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Masterarbeit Elektroden auf Basis von stickstodotierten Carbon Nanotubes hergestellt und anschließend mit geeigneten Kupfer bzw. Kupfer(I)-Oxid-Katalysatoren modiziert. In einer eigens für diesen Zweck designten elektrochemischen Zelle wurde die Performance dieser Elektroden in der elektrokatalytischen Reduktion von CO2 unter verschiedenen Versuchsparametern untersucht.
Cell-Sheet-Layer Systeme für eine 3D und gezielte Ko-Kultivierung von Leberzellen. - Ilmenau. - 102 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2018
Die Masterarbeit befasst sich mit der Kultivierung von Zellen auf einer dreidimensionalen, faltbaren Struktur, einem Cell-Sheet-Layer, welche an den Feinbau der Leber angelehnt sind, sowie deren Einbringung in einen Bioreaktor. Ziel ist es, später eine automatisierte Kultivierung über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten. So ist es möglich, Vitalität, Effizienz und Sensibilität des Systems zu überprüfen und unter Umständen mit dem In vivo Zustand zu vergleichen. Hintergrund ist die Relevanz von einfachen, menschlichen Testsystemen in der Medizin. Jährlich entstehen hohe Kosten durch zurückgerufene Medikamente durch unerwünschte Nebenwirkungen. Zu diesem Zweck wurden bei der Ko-Kultivierung von nicht-primären, menschlichen Hepatozyten (HepG2) und Endothelzellen (EA.hy926) auf Cell-Sheet-Layer verschiedene Parameter mittels Rasterelektronenmikroskop, Immunfluoreszenzfärbung, Lebend-Tod-Färbung und Albuminspezifischen ELISA untersucht. Es wurden geeignete Passagenzahlen der ausgesäten Zellen gefunden. Ein positiver Effekt konnte durch eine größere Zellzahl der ausgesäten Endothelzellen nachgewiesen werden, ebenso wie die Relevanz der Faltrichtung der Cell-Sheet-Layer und die Reihenfolge der Auftragung der Zelltypen. Darüber hinaus konnte mittels Immunfluoreszenzfärbung eine Charakterisierung der Zellen und eine räumliche Trennung der Zelltypen auf den Cell-Sheet-Layer gezeigt werden. Die Vitalität der auf den Cell-Sheet-Layer ko-kultivierten Zellen, sowie die Funktionalität der Hepatozyten wurden mittels einer Lebend-Tod-Färbung bzw. einer Bestimmung der produzierten Albuminmenge untersucht. Es wurde ebenfalls bestätigt, dass die ermittelten Parameter für die nicht-primären Zelllinien für eine Ko-Kultivierung von primären Hepatozyten (von Upcyte®) und Endothelzllen (Sinusendothelzellen der Leber von Upcyte®) genutzt werden können. Ebenso konnte mittels Immunfluoreszenzfärbung die Charakterisierung der Zellen und deren räumliche Trennung nachgewiesen werden. Aus den gewonnenen Erkenntnissen lässt sich schließen, dass die verwendeten Cell-Sheet-Layer und Bioreaktoren für eine Ko-Kultivierung von Hepatozyten und Endothelzellen geeignet sind. In zukünftigen Experimenten müssen die Ergebnisse weiter verifiziert und für eine Langzeituntersuchung angepasst werden.
Vernetzung von HRP-Molekülen mithilfe PEG-basierter Linker zur Herstellung ultrasensitiver Detektionskonjugate für Assaysysteme. - Ilmenau. - 60 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2018
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von ultrasensitiven HRP-Konjugaten für Assaysysteme. HRP-Moleküle wurden über PEG-basierte Vinylsulfon- und Amin-Linker miteinander vernetzt, um größere und damit leistungsstärkere Detektionsmoleküle zu synthetisieren. Dabei wurden die Reaktionsparameter pH-Wert, Verlinkungsreagenz, Reaktionszeit- und temperatur sowie Homogenisierungsmethode variiert und optimiert. Streptavidin konnte in situ direkt eingeführt werden, wodurch zeitraubende und verlust-bringende nachgestellte Reaktionen umgangen wurden. Untersuchungen zur sekundären und tertiären Vernetzung brachten große, leistungsstarke Konjugate hervor, die im Assay zu einer erheblichen Sensitivitätssteigerung führten. Die Produkte der Kopplung wurden mittels Größenausschlusschromatographie und Asymmetrischer Fluss Feld-Fluss-Fraktionierung, einer relativ neuen und auf diesem Gebiet noch kaum verwendeten Technologie, analysiert. Die Leistung im Immunoassay wurde anhand eines hCRP-ELISA getestet.
Entwicklung digital mikrofluidischer Assays für die Identifizierung Biopolymer-verwertender Mikroorganismen und mikrobieller Konsortien am Beispiel des Biopolymers Pektin. - Ilmenau. - 59, 32 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2018
Die vorliegende Bachelorthesis beschäftigt sich mit der Entwicklung, Erprobung und Analyse von mikrofluidischer Assays für die Identifizierung von sich bildender mikrobieller Konsortien unter nährstofflimitierenden Bedingungen. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung dieser Konsortien in den generierten Tropfen. Dazu wurden Pektinverwertende Organismen aus einer Bodenprobe isoliert und unter mikrofluidischen Bedingungen kultiviert. Um eine Konsortienbildung zu garantieren, wurden die isolierten Hefestämme in eine Co-Kultivierung mit einem Zusatz der in der Bodenprobe enthaltenen Mikroorganismen gebracht. Die Hefezellen degradieren das Pektin und versorgen so innerhalb des Tropfens die in der Erdprobe befindlichen Mikroorgansimen mit einer minimalen kontinuierlichen Zufuhr an Nährstoffen. Durch das geringe Nährstoffangebot wird gleichzeitig eine Überprofilierung einzelner, schnell wachsender Spezies unterdrückt. Das Ergebnis dieser Arbeit bestätigt, dass eine Co-Kultivierung und damit verbundener mikrobieller Konsortienbildung möglich und diese optisch auswertbar ist.
Untersuchung einer möglichen Aktivierung und Charakterisierung der bakteriellen CRISPR-Region nach einer Infektion der Bakterien durch verschiedene Bakteriophagen. - Ilmenau. - 49 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2018
Bakterien sind in der Lage sich mit Hilfe ihres Immunsystems vor Fremd - DNA zu schützen. Das CRISPR/Cas - System ist dabei ein fester Bestandteil der adaptiven und vererbbaren Immunabwehr, da es an eine Ziel-DNA spezifisch binden kann, um Doppelstrangbrüche zu erzeugen. Daher dient es als wirksames Werkzeug in der Gentechnik. Gegenstand dieser Arbeit war die Aktivierung der Typ I - Methode des CRISPR/Cas - Systems zum Aufrufen einer Immunabwehr eines E. coli - Stammes gegenüber mehreren Phagentypen (T4, T7, Qß), um ein besseres Verständnis der Koevolution zwischen Bakterien und Phagen sowie der Genregulation zu bekommen.
Etablierung und Charakterisierung eines Kokulturmodells aus primären humanen upcyte®-Hepatozyten und -sinusoidalen Leberendothelzellen. - Ilmenau. - 36 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2018
Das Ziel der Arbeit war es, ein Kokulturmodell aus primären upcyte® Hepatozyten und sinuosidalen Leberendothelzellen (LSECs) zu etablieren und zu charakterisieren. Die Schwierigkeit bestand insbesondere darin, eine Methode zum Mediumwechsel zu finden, die förderlich auf die Vitalität und Funktionalität beider Zellspezies wirkt. Hierzu wurden die Auswirkungen eines separaten, kompletten und eines Halbmediumwechsels auf zweidimensionale und dreidimensionale Mono- und Kokulturen hinsichtlich der Vitalität, Zellzahl und Albuminproduktion der Hepatozyten nach einer Woche erfasst. Zusätzlich wurden dieselben Bedingungen nach Wachstum der LSECs auf unterschiedlichen Matrigelen® getestet. Auf der Grundlage dieser Daten wurden die besten Bedingungen für die Kokultivierung über drei Wochen ausgewählt. Vorversuche mit 7 Tagen Wachstum zeigten, dass die Hepatozyten als auch die LSECs in der Kokultur eine gute Vitalität (˜70%) aufwiesen. Die Proliferation der Hepatozyten in der 3D-Mono und Kokultur war aufgrund der Scaffoldkultivierung vermindert. Jedoch konnte eine deutlich gesteigerte Albuminproduktion in der 3D Mono- und Kokultur gegenüber der 2D Monokultur nachgewiesen werden. Versuche mit Matrigel/Medium Mix als extrazelluläre Matrix für das LSEC-Wachstum konnten eine nochmalige Steigerung der Albuminproduktion in den Kokulturen gegenüber 3D-Monokulturen aufweisen; jedoch war die Vitalität der LSECs ungenügend. Der Halbmediumwechsel stellte sich als die günstigste Bedingung für eine Langzeitkokultivierung heraus, da hier vor allem die Albuminproduktion am höchsten war. Die Vitalität der Hepatozyten war in der Langzeitkultivierung konstant, während die LSECs nur über zwei Wochen stabil waren. Die Kokulturen zeigten eine konstante Albuminproduktion über 21 Tage, die gegenüber der einfachen 2D-Monokultur etwa doppelt so groß war. Bei den LSECs konnten auch nach 2 Wochen Kokultivierung noch Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie nachgewiesen werden, was auf den differenzierten Zellzustand schließen lässt. Zusätzlich bildeten die LSECs während der Kokultivierung mit Hepatozyten Kapillaren aus; ein Hinweis auf eine parakrine Interaktion zwischen LSECs und Hepatozyten. Bei in vitro Wirkstofftests spielt es eine wichtige Rolle, mit einem auch in vivo relevanten Lebermodell zu arbeiten. Eine etablierte und charakterisierte 3D Kokultur kann dies besser darstellen als eine Monokultur.
Darstellung und Charakterisierung neuartiger fluoreszenter Thiazolderivate. - Ilmenau. - 43 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2018
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Darstellung und Charakterisierung elf neuartiger fluoreszenter Thiazolderivate. Als Ausgangstoff diente ein 4-Hydroxythiazol mit einem Pyridinrest in Position zwei. Es wurden unterschiedliche Substituenten in Position fünf eingeführt, unter anderem eine Aldehydgruppe, ein Nitril, ein Amid und ein Carbonsäurerest. Mittels Claisenkondensation wurden Diketone hergestellt welche Anwendung als Metallkomplexierer finden können. Die Charakterisierung der Derivate erfolgte mittels 1H-NMR, 13C-NMR, Dept-NMR, IR-Spektroskopie, Schmelzpunktbestimmung, MS-ESI-Messungen, Fluoreszenzmessungen und Elementaranalyse.
Evaluierung photometrischer Assays zur Detektion von D-Glukose und L-Laktat : basierend auf Absorptions- bzw. Lumineszenzmessungen von gekoppelt enzymatisch katalysierten Reaktionen hinsichtlich ihrer Eignung als mikroskalierte at-line Qualitätskontrolle des Mediums in der vollautomatisierten Kultivierung von humanen adipösen Stammzellen (hADSC). - Ilmenau. - 125 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2018
Gegenstand der hier vorgestellten Arbeit ist die Evaluierung photometrischer Assays zur Detektion der Metaboliten D-Glukose und L-Laktat für eine at-line Qualitätskontrolle in einer vollautomatisierten Zellkultivierungsanlage. Der Evaluierungsprozess umfasst eine Markt- und Literaturrecherche sowie eine daraus konzipierte Bewertungsmatrix der unterschiedlichen, kommerziell verfügbaren Assays. Auf Basis der Bewertungsmatrix wurden drei Assays für die Detektion von Glukose und zwei Assays für die Detektion von Laktat ausgewählt. Die Proben für die Assays wurden aus einer automatisiert kultivierten Zellkultur von hADSCs generiert. Anschließend wurden die Assays auf ihre Präzision, Richtigkeit und Kosten untereinander bewertet. Weiterhin wurde ein Vergleich der Assays zu drei kommerziell verfügbaren stand-alone-Lösungen in Bezug auf Automatisierbarkeit, Kosten und Effizienz durchgeführt. Zusätzlich wurden die Assays in Bezug auf ihre Integrationsfähigkeit in die Prozesskette einer automatisierten Anlage bewertet. Im Rahmen der Evaluation wird in dieser Arbeit ein umfassendes Bild erstellt über verschiedene photometrische Detektionsmethoden von Metaboliten zur at-line Qualitätskontrolle und ihrer Realisierbarkeit im Zuge einer Vollautomatisierung.
Strukturierung und Analyse von Kompartimenten aus nativen Polymeren über Multi-Photonen-Polymerisation zur Anheftung von humanen Zellen. - Ilmenau. - 77 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2018
In der vorliegenden Arbeit wurde die Strukturierungsfähigkeit nativer Proteine wie Kollagen oder Fibrinogen und verschiedener Blutproben mittels Multi-Photonen-Polymerisation ohne Zugabe eines Photoinitiators getestet. Es wurden Rasterstrukturen mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten und Laserleistungen hergestellt. Dabei konnte herausgefunden werden, dass die Erstellung erhabener Strukturen ohne die Zugabe eines Photoinitiators unter den getesteten Parametern ausschließlich aus humanem Blutplasma möglich ist. Es wird angenommen, dass bei Kollagen und Fibrinogen andere Mechanismen, wie Multi-Photonen-Ionisation oder das Verdampfen des Materials aufgrund des unerwartet hohen Wärmeeintrags zu den beobachteten muldenartigen Strukturen führten.