Erzeugung membrangängiger Liposomen zum Einbringen von DNA in eukaryotischen Zellen. - Ilmenau. - 65 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2023
In dem ersten Teil dieser Masterarbeit wurde eine Methode für die Herstellung von Liposomen, die aus Cholesterol, PEG-2000 und DSPC bestehen, entwickelt. Um die Methode zu etablieren und die beste Partikelgrößenverteilung mit der kleinsten Standardabweichung und der größten Anzahl an Liposomen zu erzeugen, wurden verschiedene Parameter wie zum Beispiel Mischungsart, -zeit, und -temperatur optimiert. Die besten Ergebnisse wurden mit Ultraschall mit einer Mischungsart von 120 min bei einer Temperatur zwischen 60 und 70 ˚C erzielt. Die Methode produziert reproduzierbare LNPs mit einem mittleren Radius von 2,2 μm und einer Standardabweichung von 0,1 μm. Die Charakterisierung der Lösungen wurde mittels Lichtmikroskopie und einer statistischen Auswertung der erhaltenen Bilder mithilfe der Software FIJI durchgeführt. Die optimierte Methode wurde verwendet, um T7-DNA als Testsystem für ein therapeutisches Mittel einzukapseln. Dafür wurde Lipofectamine 3000® als katonisches Lipid verwendet, das die Verkapselung der T7-DNA fördert. Um die Verkapselungsfähigkeit auswerten zu können, wurde eine Färbung des T7-Genoms mit PI durchgeführt und durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Verkapselung wurde mit der Beobachtung von fluoreszierenden Liposomclustern überprüft, wobei die kugelförmigen LNPs unterscheidbar sind. Zur Reinigung dieser Liposomenlösung wurde eine Methode entwickelt, die auf Zentrifugation und Redispergierung in TE-Puffer basiert. Eine optimale Reinigung der Lösung wurde mit einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 4000 RPM (1789 G-Force) für 5 Minuten bei 4 ˚C und 6 edispergierungsschritten in Puffer erreicht, ohne die Stabilität oder morphologischen Eigenschaften der Liposomen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde als Ergebnis dieses Prozesses eine homogene Lösung erhalten. Auf der anderen Seite wurde die Schutzfähigkeit der LNPs in Bezug auf die T7-DNA anhand der Verwendung einer Endonuklease (DNase I) bewertet. Die Stabilität der Liposomen wurde durch Fluoreszenzbilder und Lichtmikroskopie untersucht, die Ergebnisse zeigen, dass die Liposomen die Fähigkeit haben, das T7-Gemon vor dem Nukleaseverdau zu schützen. Zum Schluss wurde die Infektionsfähigkeit der Liposomen mit eingekapselter T7-DNA durch einen in vitro Test an einer Zellkultur der Linie HEP-G2 ausgewertet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den Vergleich einer Negativkontrolle mit einer Dreifachprobe sowohl durch Fluoreszenzmikroskopie mit Färbung als auch anhand des Cell Counter CASY®untersucht. Liposomen bewirken eine Verringerung des Anteils der lebensfähigen Zellen um 24,7 %, was durch Fluoreszenzmikroskopiebilder bestätigt wurde. Aus den in dieser Masterarbeit gewonnenen Erkenntnissen kann im Wesentlichen geschlossen werden, dass die entwickelte Methode die Herstellung stabiler Liposomen mit der Fähigkeit, DNA aus dem T7-Bakteriophagen einzukapseln, zu schützen und in eine eukaryotischen Zelle der Hep-G2-Zelllinie zu transportieren und zu infizieren, gelungen ist.
Modellierung von in vivo Mikrotopografien durch folienbasierte Formenstrategien und Kokultivierung von Zellen. - Ilmenau. - 78 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2023
Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, eine Methode zu entwickeln, die ein gezieltes Zellwachstum auf beiden Seiten eines mikrostrukturierten 3D-Zellgerüsts ermöglicht. Eine Seite wurde durch das Microcontactprinting strukturiert, während die Strukturierung der anderen Seite nach Auftrag des Zellrasens erfolgte. Die neue Methode des Wipings ermöglicht das gezielte Entfernen von Zellen auf höhergelegenen Bereichen eines Scaffolds. Sie wurde an Lines and Spaces-Strukturen, die aus einer porösen Polycarbonatfolie hergestellt und mit einer Kokultur aus EA.hy926- und HepG2-Zellen besiedelt wurden, ausgearbeitet. Es wurde das Wiping sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur untersucht und etabliert. Mehrere fragliche Parameter, die das Ergebnis des Wipings beeinflussen, wurden optimiert. Zudem wurde neben der Schaffung der notwendigen fluidischen Randbedingungen ein einfaches Protokoll ausgearbeitet, dass reproduzierbare Ergebnisse in guter Qualität ermöglicht Als Nachweis eines erfolgreichen Wipings wurden Untersuchungen unter dem Lichtmikroskop, dem Rasterelektronenmikroskop und dem Laserscanningmikroskop vorgenommen sowie Life-Dead-, Immunfluoreszenz-, DAPI- und Aktinzytoskelett-Färbungen vorgenommen. Mit Ausblick auf weitere Untersuchungen wurde zudem probeweise eine wabenförmige Struktur ausgetestet.
Charakterisierung der Keanumycinbildung im Labormaßstab. - Ilmenau. - 53 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
Pflanzenschutzmittel sind in der heutigen Zeit unumgänglich. Hierbei wird täglich nach neuen Mitteln gesucht, um Pathogene effektiv bekämpfen zu können ohne die Pflanzen zu schädigen. Dabei zeigten sich besonders die cyclischen Lipopeptide als vielversprechend. Ein Vertreter dieser Klasse ist das Keanumycin A, welches vom Bakterium Pseudomonas fluorescens produziert wird. Das Keanumycin A zeigt eine sehr starke antimykotische Wirkung. Somit eignet es sich gut für die landwirtschaftliche Anwendung. In dieser Bachelorarbeit wurde die Keanumycinproduktion unter Variation des Mediums, sowie der Verfahrenstechnik untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass eine Erhöhung der Kohlenstoffquelle sich positiv auf die Keanumycinproduktion ausübt. Bei erhöhter Kohlenstoffquelle im Batch-Ansatz konnte eine Steigerung von 254 % (3,23 mg/l) erreicht werden. Bei Verwendung eines Fed-Batch-Prozesses wurde eine Maximalkonzentration von 5,32 mg/l (419 %) erreicht. Schlagwörter: Antimykotisch, Cyclische Lipopeptide, Pseudomonas fluorescens, Keanumycin, Pflanzenschutzmittel
Etablierung des Comet-Assays zur Detektion von DNA-Schädigungen in Lungenzellen nach der Exposition mit TiO2-Nanopartikeln. - Ilmenau. - 60 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
Die Desoxyribonukleinsäure (DNA) stellt den Träger der Erbinformation eines Organismus dar und ist für die Übertragung dieser Information zur nächsten Generation verantwortlich. Die Aufrechterhaltung der Stabilität und Integrität des Genoms ist daher eine unverzichtbare Voraussetzung für die Teilung und das Wachstum der Zellen. Täglich erfährt jede Zelle des menschlichen Körpers über zehntausende von DNA-Schäden. Infolge von unvollendeter oder ausbleibender Reparatur kann die Erhaltung des genetischen Materials und die Lebensfähigkeit einzelner Zellen sowie des gesamten Organismus gefährdet werden. Um Informationen über auftretende DNA-Schäden zu erhalten, ist die Etablierung und Entwicklung von zuverlässigen und schnellen Nachweismethoden erforderlich. In der vorliegenden Abschlussarbeit wurde die Etablierung einer solchen Nachweismethode, des Comet-Assays bzw. SCGE (single cell gel electrophoresis) unter Verwendung von A549-Lungenepithelzellen durchgeführt und mit verschiedenen DNA-schädigenden Substanzen getestet. Während Ausarbeitung der Positivkontrollen für den Assay mit den Substanzen Wasserstoffperoxid und Methylmethansulfonat wurden Konzentrations- und zeitabhängige DNA-Schäden erfolgreich induziert. Ebenfalls wurde die Möglichkeit untersucht, die Reparatur der DNA mittels Aphidicolin zu unterdrücken, um stärkere DNA-Schäden zu erwirken. Die verstärkte DNA-Schädigung konnte im Comet-Assay nachgewiesen werden. Die Zelltoxizität der verwendeten DNA-schädigenden Substanzen wurde mittels Alamar Blue®-Assay untersucht. Es wurde eine Veränderung der zellulären Lebensfähigkeit im Zusammenhang mit der Natur, Konzentration und Anwendungsdauer der angewandten Substanzen beobachtet, allerdings keine endgültige Korrelation zwischen dem Auftreten der DNA-Schädigung und zellulärer Lebensfähigkeit. Anschließend wurde der Einfluss von TiO2-Nanopartikel-Aerosolen unter zwei verschiedenen Expositionsbedingungen (air-liquid interface (ALI) und liquid-liquid interface (LLI)) auf die DNA-Integrität von MatriGrid®-kultivierten A549-Lungenepithelzellen untersucht. Dies wurde mit Hilfe eines im Fachgebiet Nanobiosystemtechnik entwickelten Lungen-Expositionssystems (MALIES) durchgeführt. Es konnte eine Schädigung der DNA beobachtet werden, wobei diese je nach Expositionsbedingungen (LLI oder ALI) sehr unterschiedlich war. Die Exposition unter physiologisch relevanten ALI-Kultivierungsbedingungen zeigte einen stärker ausgeprägten toxischen Effekt der TiO2-Nanopartikel auf die DNA der A549-Zellen als unter LLI-Bedingungen.
Scope of waste polycarbonate as carbonylating agent for the synthesis of activated furan derivatives. - Ilmenau. - 53 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
Das chemische Recycling von Polycarbonat (PC) und die Herstellung neuer reaktiver Furane als DASA-Vorläufer stellen einen vielversprechenden Ansatz zur Bekämpfung der Kunststoffverschmutzung dar. Diese innovative Methode ermöglicht die Isolierung und Charakterisierung neuer DASA-Vorläuferstoffe und eröffnet Möglichkeiten für deren weitere Entwicklung und Erforschung. Die potenziellen Anwendungen dieser neuen reaktiven Furane sind umfangreich und vielfältig. Eine spannende Perspektive ist die Fähigkeit, Biomoleküle zu verbinden oder neue funktionelle Gruppen durch Click-Reaktionen einzuführen. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuartiger Materialien und Oberflächenmodifikationen. Insbesondere können die reaktiven Furane an Polycarbonat-Oberflächen gebunden werden, die mit verzweigtem Polyethylenimin (BPEI) funktionalisiert sind, um DASA-basierte Beschichtungen zu schaffen. Die Strukturiertheit und Belastbarkeit dieser Beschichtungen kann durch photolithographische Techniken gemessen werden. Außerdem können die Benetzungseigenschaften der Oberflächen durch Photoreaktionen verändert werden, was zusätzliche Kontrolle und Vielseitigkeit bietet. Eine wichtige potenzielle Anwendung dieser Studie ist die Kontrolle und Strukturierung der Zelladhäsion auf diesen DASA-beschichteten Oberflächen durch Licht. Azidoglukosekonjugate können verwendet werden, um Zellen an die Oberflächen zu binden, was eine präzise Manipulation und Strukturierung der Zelladhäsion ermöglicht. Darüber hinaus können auch andere Biomoleküle mit Hilfe der DASA-Chemie auf den PC-Oberflächen immobilisiert werden, wie in dieser Forschung beschrieben. Insgesamt eröffnet diese Studie neue Möglichkeiten für die Entwicklung von funktionellen Materialien, Oberflächenmodifikationen und die Kontrolle der Zelladhäsion mit DASA-basierten Systemen. Die genauen Funktionen und Anwendungen der neu synthetisierten reaktiven Furane müssen noch vollständig erforscht werden, was spannende Möglichkeiten für die zukünftige Forschung und Entwicklung auf dem Gebiet der Materialwissenschaften und des Bioengineering bietet.
Isotherme Amplifikationsmethoden LAMP und 3SR. - Ilmenau. - 59 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
In der Arbeit wurden zwei isotherme Amplifikationsmethoden LAMP und 3SR miteinander verglichen. Die Reaktionsparameter Temperatur, Reaktionszeit, Arbeitskonzentration des Templates, sowie die Primer-Zusammensetzungen der LAMP-Amplifikation wurden variiert, um die Optima zu ermitteln. Die optimalen Parameter des LAMP Assays, für einen bestimmten Abschnitt des T7-Phagen Genoms, konnten erfolgreich bestimmt werden. Die Amplifikation war mit kurzen Reaktionszeiten durchführbar und die visuelle Auswertung durch den colorimetrischen Master-Mix erwies sich als einfach auswertbar und sehr zuverlässig. Allerdings zeigte sich, dass die hohe Anfälligkeit der LAMP für falsch positive Ergebnisse durch Carry-over-Kontamination sie unter den aktuellen räumlichen Bedingungen im Labor ungeeignet macht. Die Amplifikation durch 3SR wurde anhand eines 200 bp langen, synthetisch hergestellten DNA-Produktes durchgeführt. Es wurden vier verschiedene Reaktionsbedingungen nach drei verschiedenen Autoren verglichen. Das Protokoll nach den Bedingungen von R. Breaker und G.F. Joyce hat sich als erfolgreiches Protokoll für die 3SR bewiesen, welches Amplikongrößen bis zu 800 bp amplifizieren kann. Um das virale T7-Genom zu gewinnen, wurden verschiedene Protokolle auf Ausbeute und Reinheit der erhaltenen genomischen DNA verglichen. Die abgeänderte und verkürzte Form des Protokolls nach Džiuginta Jakočiōun&ptbov;e und Arshnee Moodle erwies sich als geeignet und lieferte in beiden Kategorien gute Ergebnisse.
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2023
Die gezielte Verabreichung von Arzneimitteln in der Krebstherapie ist eine wirksame Strategie zur selektiven Bekämpfung von Tumorgewebe. Ein vielversprechender Ansatz in der modernen Krebsimmuntherapie ist die gezielte Ansprache spezifischer Tumormembranproteine für die Verabreichung von Antikörper-Konjugaten zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken. Für die Entwicklung von hochaffinen und spezifischen Antikörpern sind effiziente Hochdurchsatz-Screening-Verfahren von großer Bedeutung. Phage Display in Kombination mit einer synthetischen Bibliothek ist eine schnelle und leistungsfähige Technik zur Auswahl von Antikörpern, die auf der genetischen Manipulation von filamentösen Bakteriophagen beruht. In der vorliegenden Arbeit wurde das etablierte Hit-Identifikationsverfahren angewandt, um neue VHH Single-Domain-Antikörper zu identifizieren, die aus einer hochdiversen synthetischen Bibliothek gegen ein definiertes Zielprotein in der Transmembranregion bestimmter Tumorzellen stammen. Des Weiteren wurde getestet, ob eine Hitze-Inkubation der Phagen vor dem Bio-Panning die Trefferzahlen beeinflusst. Das angewandte Screening führte zur Identifizierung neuartiger VHH Single-Domain-Antikörper, von denen einige eine Kreuzreaktivität zwischen Mensch und Maus aufweisen. Die Hitzeinkubation erwies sich bei diesem Screening als vorteilhaft. Eine Charakterisierung der identifizierten VHH's wird durchgeführt werden. Auf der Grundlage dieser Daten werden die VHH's für eine Anwendung in verschiedenen Projekten bewertet.
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2023
Der 3D-Druck von Kunststoffen und das Bioprinting von 3D-Strukturen aus Gelatine-Alginat-Hydrogelen, die eine oder mehrere Zelllinien beherbergen, eröffnen dem Forschenden eine Vielzahl von Möglichkeiten, durch die individuelle Gestaltung sowohl der Reaktorgeometrien als auch der dreidimensionalen Zellkonstrukte, die idealen Kulturbedingungen für die jeweilige Versuchssituation zu erschaffen. In dieser Arbeit wurde ein Weg entwickelt einen miniaturisierten Bioreaktor aus dem Kunststoff Cyclo-Olefincopolymer (COC 5013) im Schmelzschichtverfahren (Fused Deposition Modeling) auf einen Objektträger aus COC 6015 zu drucken. Durch die Verwendung von COC 5013 als Werkstoff war es möglich die gefertigten mini-Bioreaktoren mehrfach zu verwenden, da der Kunststoff bei 121˚C im Autoklaven formstabil blieb. Die Kultivierung einer ebenfalls 3D-gedruckten HepG2-Kultur in Gelatine-Alginat-Hydrogel über 14 Tage erwies sich als durchführbar, ebenso wie die Kultivierung von HUVEC und HepG2 als dreidimensionale Co-Kultur in einem prävaskularisierten Hydrogelkonstrukt. Während der Kultivierung zeigte sich jedoch, dass die nicht vorhandene Gaspermeabilität des Reaktorwerkstoffs, anders als bei Reaktoren aus PDMS, bei niedrigen Volumenströmen des Nährmediums zu schwerwiegendem Sauerstoffmangel sowie einem Anstieg der CO2-Konzentration im Reaktionsraum führte. Dies führte zu verminderter Zellaktivität der 3D-Zellkultur im Reaktor gegenüber der statischen Kontrollkultur, jedoch erwies sich eine Erhöhung des Mediendurchsatzes im Reaktor als eine geeignete Maßnahme um die Zellkultur erfolgreich zu betreiben. Im Falle weiterer Versuche mit diesem Reaktortyp wären bauliche Veränderungen zur Verbesserung des Gasaustauschs dennoch angebracht.
Amplifikation und Untersuchung verschiedener Phagengene aus Passageexperimenten. - Ilmenau. - 62 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2023
Im Laufe der Zeit kann sich eine Population von Individuen genotypisch und phänotypisch verändern. Anhand der Evolution von einer Viren- bzw. Phagenpopulation kann man untersuchen, wie sich die Individuen verhalten. Im Gegensatz zu RNA-Viren wurden DNA-Viren diesbezüglich bis jetzt nur wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit wird die Evolution von dem nicht human-pathogenen DNA-Bakteriophagen T7 untersucht. Bereits in einigen vorhergehenden Masterarbeiten wurde gezeigt, dass sich die Fitness von T7 im Laufe der Passagen verändert, abhängig davon, ob man zur Vermehrung die Plaque-to-Plaque-Methode oder large-scale Passagen einsetzt. Dies lässt sich anhand der Theorien von Muller’s Ratchet und von der Red Queen-Hypothese (RQH) erklären. Diese Arbeit sollte als eine Erweiterung der Untersuchung der Evolution des Bakteriophagen T7 dienen. Hierfür wird sein Genom mit Hilfe von Amplifikationsmethoden (PCR) und eine nachfolgende Analyse mittels Restriktionsverdau untersucht.
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2022
In der vorliegenden Arbeit wurde die Kompatibilität von modifizierten Oligonukleotiden und Enzymen untersucht, welche sowohl für die Kopplung als auch für das Capping und die Polyadenylierung von RNA benötigt werden. Eingeordnet werden die Forschungen in ein Projekt zur Synthese stabilisierter mRNA aus chemisch modifizierten Oligonukleotiden. Um die Forschungsfrage zu beantworten, wurden unmodifizierte und modifizierte Oligonukleotide hergestellt und enzymatisch gekoppelt. Diese Koppelung wurde mithilfe der Splinted Ligation durchgeführt, um danach das RNA Capping und die Polyadenylierung zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass chemisch modifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden können und dass die Herstellung von einer chemisch modifizierten mRNA prinzipiell denkbar ist. Außerdem konnten Daten zur Kopplungseffizienz erhoben werden und es wurde der enzymatischer Abbau durch Modifikationen der RNA verringert, was eine Stabilisierung von mRNA durch modifizierte RNA Oligonukleotide nahelegt.