Studie von self-assembly Techniken zur kombinatorischen Gensynthese von Bausteinen aus ssDNA und dsDNA. - Ilmenau. - 77 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2017
In dieser Arbeit geht es zum einen darum, die Grundlage für den Entwurf von Modulen für die GEMOCO (Gene module combinatorics) Strategie zu schaffen. Dafür soll eine Bibliothek von DNA-Modulen entwickelt werden, welche frei kombinierbar sind. Dazu werden bekannte Proteinsequenzen näher betrachtet, um anschließend einen degenerierten Code zu designen, welcher mit größtmöglicher Wahrscheinlichkeit von einem Bakterium codiert werden kann. Zum anderen geht es um die praktische Umsetzung des Klonierens derartiger Module. Es werden self-assembly Techniken unter Verwendung von tailed Primern oder dem Einsatz von T4-DNA-Polymerase untersucht. Mit diesen Techniken sollen die entwickelten Module später kloniert werden.
Aktivierung von Polysacchariden und Herstellung von Polysaccharid-Protein-Konjugaten. - 86 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Bachelorarbeit 2016
Im Rahmen der Arbeit wurden die Polysaccharide Dextran und Cellulose mit verschiedenen funktionellen Gruppen modifiziert, um Vorstufen eines Antikörper-Polymer-Enzym-Konjugats zu synthetisieren. Es wurden Divinylsulfon-, Azid- und Trichlortriazingruppen eingeführt und die Löslichkeit der entstandenen Konjugate in Wasser dokumentiert. Die funktionellen Polysaccharide wurden dann mit Proteinen und Enzymen gekoppelt, um die Nützlichkeit der Funktionalitäten hinsichtlich eines Antikörper-Polymer-Enzym-Konjugats zu testen. Es konnte ein wasserlösliches Protein-Polymer-Enzym-Konjugat synthetisiert werden, indem zwei mit Hilfe der Click-Chemie verknüpfte Proteine mit Vinylsulfon-Dextran gekoppelt wurden.
Entwicklung eines tropfenbasierten mikrofluidischen Systems für einen zellbasierten Assay. - 109 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2016
Ziel dieser Arbeit war es, eine Alternative zum Mikrotiterplatten-basierten AlamarBlue®-Assay auf der Basis einer tropfenbasierten mikrofluidischen Plattform zu entwickeln. Um alle notwendigen Verfahrensschritte des etablierten Assays auf die mikrofluidische Plattform übertragen zu können, wurde eine Reihe funktioneller mikrofluidischer Module entwickelt und umfassend getestet. Eine Mikrocontroller-basierte Steuereinheit zum aktiven Dosieren der AlamarBlue®-Reagenz wurde im Rahmen der Masterarbeit etabliert. Der Einfluss von Phenolrot und Perfluodecalin auf die Fluoreszenzintensitäten bei unterschiedlichen Zellkonzentrationen wurde ebenso untersucht wie die potentielle toxische Wirkung von Tetradekan auf die Viabilität der verwendeten Zelllinie. Umfangreiche Untersuchungen zum Vergleich des etablierten Mikrotiterplatten-basierten AlamarBlue®-Assay zu dem im Rahmen der Masterarbeit entwickelten tropfenbasierten Assay bewiesen die Funktionalität der neuen mikrofluidischen Module und Protokolle auch als Basis für weitergehende Anwendungen.
Prozessentwicklung zur Fertigung von Zellkultursubstraten auf Basis von Hydroxylapatit. - 65 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2016
In dieser Arbeit werden die Versuche und Herangehensweisen zur Herstellung von Zellkultursubstraten auf Basis von Hydroxylapatit beschrieben. Der Aufbau gliedert sich wie folgt: Einleitung, Methoden sowie Ergebnisse und Auswertung. Das Apatit, welches hier zum Einsatz kommt, ist neben Kollagen des Typs I Hauptbestandteil des Knochens. Daher werden zu Beginn die Knochen in Aufbau, Struktur und Funktionsweise beschrieben. Damit soll ein Verständnis für die Versuche und die Begründung für die Wahl der hier im Einzelnen behandelten Materialien vermittelt werden. Dazu sind die jeweiligen Materialien in einem Überblick bezüglich ihrer Eigenschaften, sowie Einsatz und Wichtigkeit in der Biomaterial-Forschung dargestellt. In den weiteren Kapiteln werden Synthesemethoden für das Hydroxylapatit beschrieben. Dabei haben sich drei Varianten herauskristallisiert. Zudem wird neben diesem Mineral ein Material benötigt, um dem Zellkultursubstrat eine gewisse Elastizität zu geben. Dafür ist im Knochen das Kollagen zuständig. Weiterhin existieren dessen denaturierte Formen: Kollagen-Hydrolysat und Gelatine. Diese drei Varianten sind zur Folienherstellung betrachtet worden. Nach den Erläuterungen bezüglich der Methoden werden die Ergebnisse dargestellt und ausgewertet. Bei der Folienherstellung hat sich erwiesen, dass Kollagen-Hydrolysat untauglich ist. Diese Folien sind nicht für Heißpräge- und Thermoformprozesse geeignet, da sie spröde sind. Zudem lösen sie sich innerhalb kürzester Zeit in Wasser auf. Die Gelatinefolien sind flexibel. Durch Heißprägen werden diese allerdings spröde und es kommt nicht zur Strukturübertragung. Durch Gießen kann eine Strukturierung erreicht werden, aber die Strukturen sind in einer wässrigen Umgebung nicht stabil. Poröse Gelatine hingegen ließ sich heißprägen, löste sich aber vollständig im Wasser auf. In Hydroxylapatitlösung getränkte, faserige Kollagenfolien konnten durch Thermoformen strukturiert werden. Bei geringeren Temperaturen (ca. 70 ˚C) werden Strukturen teilweise übertragen. Erhöht man die Temperatur weiter, so erfolgt eine großflächige Strukturierung, allerdings kommt es dabei zur Denaturierung des Kollagens. Die Strukturen lösen sich innerhalb einiger Stunden in Wasser auf. Allgemein wird der Einsatz von faserigen Kollagen in Verbindung mit Hydroxylapatit als mögliches Zellkultursubstrat beschrieben.
Mikromechanische und histologische Analyse von Tumor-Gewebeschnitten auf zellulärer und suprazellulärer Ebene. - 110 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2016
Für die Tumorentstehung und Progression ist neben der genetischen Veränderung die Wechselwirkung mit der Mikroumgebung entscheidend. Aus diesem Grund ergeben sich für die Etablierung eines organotypischen 3D-Tumormodells zwei wesentliche Anforderungen. Für eine biomechanische Optimierung muss die Mechanik des nativen Tumors und des gesunden Gewebes bekannt sein (materialseitiger Anspruch). Außerdem müssen die zellulären Zusammenhänge und Wechselwirkungen zwischen entarteten und nicht entarteten Zellen aufgeklärt werden (biologischer Anspruch). In der Arbeit wurden mechanische und histologische Untersuchungen auf zelluläre und suprazelluläre Ebene durchgeführt. Für die mechanische Untersuchung an entarteten und nicht entarteten Einzelzellen des Brustepithels wurde die kolloidale Kraftspektroskopie mit dem AFM angewandt und die Histologie durch Färbung des Aktinskeletts beurteilt. Für die Untersuchung von Brusttumorgewebe und gesundem Brustgewebe der Maus, wurde die Kraftspektroskopie mit einem mikromechanischen Testsystem und für die Histologie eine HE-Färbung und Kollagen-Färbung durchgeführt. Die Tumorzelllinie MDA-MB-231 (0,8 - 15,4 kPa) war signifikant weicher als die gesunde Zelllinie MCF-12A (2,6 - 19,3 kPa). Zurückzuführen ist dies auf eine geringere Aktinpolymerisation in Folge der EMT. Das Brusttumorgewebe war mit einem E-Modul-Bereich von 12,4 - 271 kPa signifikant steifer als das gesunde Gewebe (0,8 - 10,3 kPa). Außerdem besaß das Tumorgewebe eine größere mechanische Inhomogenität. Die Gewebeversteifung entsteht durch eine gestiegene Kollagenablagerung in der ECM (Desmoplasie). Die erhöhte Kollagenablagerung sorgt für die Bildung von Integrin-Clustern. Durch das Mechanosensing der Zellen wird über das Zytoskelett, durch die Cluster, die Genexpression verändert und bewirkt eine weitere Versteifung der ECM durch Produktion von ECM-Komponenten durch Tumorzellen und Stromazellen. Damit existiert eine direkte Verbindung der genetischen Faktoren und Umgebungs-Faktoren für eine Tumorentwicklung. Mit der LCM-Plattform kann ein Scaffold-basiertes 3D Modell im Bereich der Tumorsteifigkeit erstellt werden. Für die Untersuchung der mechanischen Auswirkung der Mikroumgebung auf Tumorzellen ist eine Monokultur möglich. Jedoch sollte für Untersuchung neuer Therapeutika die Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und Stromazellen berücksichtig werden. Dazu eignet sich eine Cokultur, für eine bessere in vivo Annäherung.
Elektrische Charakterisierung von L929 Fibroblasten mittels Mikroelektroden. - Ilmenau : Universitätsbibliothek. - 1 Online-Ressource (VII, 59 Seiten)
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2016
Ziel dieser Arbeit war es, Signale von Zellen mittels Mikroelektroden aufzunehmen und mit einer Whole-Cell-Clamp Anordnung als etablierte Referenzmethode eine simultane Messung vorzunehmen. Bei der Auswertung der Signale der Zelle sollten dann überdies die elektrischen Eigenschaften der Mikroelektroden mit berücksichtigt werden. Einen Schwerpunkt der Arbeit bildete aber vor allem der Prozess der Herstellung der Mikroelektroden aus Kohlefasern und Bonddrähten aus Gold. Im Rahmen dieser Arbeit ist es aber nicht gelungen, eine simultane Messung durchzuführen. Genauso wenig ist es gelungen, Unterschiede der Signale der Mikroelektroden alleine im Vergleich zu Signalen der Mikroelektroden in Kontakt mit den Zellen auszumachen. Jedoch konnten schließlich die elektrischen Eigenschaften einer Mikroelektrode im Zuge einer Verdünnungsreihe mittels Impedanzspektroskopie präzise untersucht werden.
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:gbv:ilm1-2016200046
Untersuchungen zum Einfluss physikochemischer Parameter von Biomaterialien auf die Adhäsion von Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis. - 91 Seiten
Technische Universität Ilmenau, Masterarbeit 2016
Mikroorganismen treten in der Natur fast immer in Form von Biofilmen auf verschiedensten Oberflächen auf. Aber auch auf medizinischen Geräten und auf Implantaten können sich Biofilme bilden, was im menschlichen Körper zu Infektionen und Entzündungen, oder zum Funktionsverlust von Implantaten führen kann. Aus diesem Grund gewinnt die Entwicklung von Antifouling-Strategien zunehmend an Bedeutung. Da die Bildung eines Biofilmes durch die Adhäsion von Bakterien an die Oberfläche initiiert wird, beruhen die Strategien immer häufiger auf der Unterbindung der Adhäsion. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von physikochemischen Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien auf die bakterielle Adhäsion untersucht. Dazu wurden dynamische Adhäsionskinetiken, durch welche sich realitätsnahe Bedingungen schaffen ließen, mit vier verschiedenen Konzentrationen einer Mischkultur aus Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis durchgeführt. Als Modelloberflächen dienten mit TEGO®Phobe beschichtete Objektträger, welche im Sauerstoffplasma funktionalisiert wurden, um eine abgestufte Benetzbarkeit und Ladung der Oberfläche einzustellen. Durch die Ermittlung von zeit-und konzentrationsunabhängigen Parametern sollte schließlich eine materialspezifische Bewertung der Modelloberflächen ermöglicht werden. Die Untersuchungen ergaben, dass die bakterielle Adhäsion abhängig von der Zeit, von der Bakterienkonzentration und von den physikochemischen Eigenschaften der Biomaterialoberfläche ist. So wurde durch Extrapolation der Oberflächenbesiedlung bei sehr niedrigen und bei unendlich hohen Bakterienkonzentrationen festgestellt, dass der physikochemische Einfluss der Materialoberfläche mit steigender Bakterienkonzentration abnimmt. Bei sehr geringen bis moderaten Konzentrationen ist nachweislich die Affinität der Mischkultur zu sehr hydrophilen Oberflächen deutlich geringer als zu hydrophoberen Oberflächen. Dieser Effekt beruht vermutlich auf unterschiedlichen Wasserstrukturen, welche sich abhängig von der Benetzbarkeit der Oberfläche ausbilden. Für die Entwicklung neuer Antifouling-Konzepte ist es demnach empfehlenswert, den Einfluss der Hydrophilie von Biomaterialien zu berücksichtigen. Jedoch muss beachtet werden, dass die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse nur für die eingesetzten Infektionserreger und die gewählten Systembedingungen gültig sind.
http://www.gbv.de/dms/ilmenau/abs/852150504schko.txt
Integration of microfluidics in 3D cell culture : applications in tissue engineering and oncology. - 106 S. : Ilmenau, Techn. Univ., Masterarbeit, 2015
Die miniaturisierten Geräte erhalten in der Biotechnologie immer mehr Aufmerksamkeit. Sie werden einerseits immer verbreiteter und zudem stetig kleiner. In dieser Arbeit werden zwei Lab-on-a-Chip-Systeme für zwei verschiedene 3D-Zellkulturen mit integrierter Mikrofluidik entwickelt. Beide Lab-on-a-Chip-Systeme werden mithilfe von Mikrofabrikation entwickelt, um benutzerdefinierte Geometrien zu realisieren und die physiologisch ähnlichen Strukturen zu replizieren. Der erste Mikrofluidik-Chip wurde mit Polycarbonat durch Computerized Numerical Control (CNC) Fräsen hergestellt. Somit kann ein Mikrokanal gefertigt werden, der eine endotheliale 3D-Zellkultur ermöglicht. Dieser kann vollständig mit einem biokompatiblen Hydrogel (Kollagen Typ I oder Fibrin) gefüllt werden und ist perfundierbar. In dieser Arbeit ließen sich die Zellen bis zu 63 h im Mikrokanal kultivieren. Der zweite Mikrofluidik-Chip wurde durch kombinierte Verwendung von 3D-Druck und CNC sowie Polymer-Technologie aufgebaut. Er enthält einen Konzentrationsgenerator und kann zum Laden der Zellsphäroide verwendet werden. Diese Masterarbeit befasst sich mit häufig auftretenden Problemen der Mikrofluidik in Lab-on-a-Chip-Systeme. Um ein stabiles System zu erhalten, müssen die Probleme in Bezug auf Luftblasen und das periphere Perfusionssystem betrachtet und gelöst werden.
Etablierung eines Untersuchungsmodells zur Freisetzung eines Ca(2+)-Kanalblockers aus organomimetisch kultivierten HepG2-Zellen. - 94 S. : Ilmenau, Techn. Univ., Masterarbeit, 2015
Innovative Forschungsansätze verfolgen das Ziel, dreidimensionale zelluläre Aggregate unterschiedlicher Ursprungsorgane in sogenannten "Body-on-a-Chip"- Systemen zu assemblieren. Daher soll in vorliegender Arbeit ein Untersuchungsmodell zur Freisetzung eines Ca(2+)-Kanalblockers aus einer Wirkstoffvorstufe durch Hepatokarzinom-Zellen, die in Polycarbonatscaffolds organomimetisch kultiviert wurden, etabliert werden. Dazu wurde die Umsetzung der diacetylierten Vorstufe des Ca(2+)-Kanalblockers Dihydropyrimidin (DHPM) in scaffoldkultivierten HepG2-Kulturen zeitlich und quantitativ mit Hilfe von HPLC/MS Analytik untersucht. Entscheidend für die Stabilität der Wirkstoffvorstufe ist die Wahl eines geeigneten Lösungsmittels, in dem die diacetylierte Vorstufe des DHPMs über einen Zeitraum von 6 h beständig ist. Basierend auf Stabilitätsuntersuchungen in verschiedenen Medien wurde DMSO/PBS als geeignetes Lösungsmittel für weiterführende Untersuchungen eingeschätzt. Eine Metabolisierung des in DMSO/PBS gelösten diacetylierten DHPMs zu den Produkten mono- und deacetyliertem DHPM durch HepG2-Zellen konnte quantitativ nachgewiesen werden. Die toxische Wirkung der Substanzen auf die Hepatokarzinom-Zellen wurde mittels etablierter zellbiologischer Methoden überprüft. Dabei wurde festgestellt, dass höhere Konzentrationen als 10 [my]g/ml des diacetyliertem DHPMs die Vitalität der Zellen negativ beeinflussen. Im weiteren Teil der Arbeit wurde die inhibierende Wirkung von DHPM und dessen di- und monoacetylierte Vorstufen auf die in Kardiomyozyten lokalisierten Kalziumkanäle analysiert. Im Bezug dazu wurden kontrahierende Kardiomyozyten aus murinen P19-Zellen differenziert und die Kanalblockeraktivität mikroskopisch und mittels Multielektrodenarray (MEA) untersucht. Eine inhibierende Wirkung der Ca(2+)-Kanäle durch Applikation von DHPM wurde dabei detektiert. Die Zugabe von di- und monoacetyliertem DHPM zeigte keinerlei Beeinflussung der Kanalblockeraktivität. Abschließend wurde ein chipbasiertes, gekoppeltes Untersuchungssystem beider Zellkulturen auf Basis festgelegter Randbedingungen konzipiert. Dadurch ist es in Zukunft möglich, die dreidimensionalen zellulären Aggregate beider Ursprungsorgane in einem sogenannten "Body-on-a-Chip"-System zu kultivieren.
Technologieentwicklung für komplexe Cell-Sheet-Layer-Systeme. - 87 S. : Ilmenau, Techn. Univ., Masterarbeit, 2015
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung von mehrlagigen folienbasierten Strukturen basierend auf Cell-Sheet-Layer-Systemen, die anhand eines abstrahierten Leber-Sinusoids demonstriert werden. Es werden verschiedene Technologien zur Herstellung mehrlagiger Cell-Sheet-Layer vorgestellt. Die Form- und Beschichtungsstrategien dieser Substrate kann Einfluss auf das Wachstum der Zellen nehmen. Als Ausgangsbasis der Trägersubstanz dient Polycarbonat-Folie mit einer Dicke von 50 [my]m, die durch den Mikrothermoformprozess die gewünschte Mikro-Topografie erhält. Es ist ein transparentes und biokompatibles Material, welches durch lokal begrenzte Oberflächenfunktionalisierungen während oder nach der topografischen Modellierung die Zelladhäsion auf den Trägern ermöglicht. Zunächst werden die vorhandene Technologie und das Werkzeug für die Mikro-Topografie optimiert, um so die gezielte Zellkultivierung zu ermöglichen. Die Polycarbonat-Folien werden nach dem Mikrothermoformprozess auf verschiedene Strategien der Zellbesiedlung untersucht. Das Cell-Sheet-Layer-System soll ein abstrahiertes Leber-Sinusoid beschreiben. Daher werden für die Außenseite des Substrates die humanen Hepatozyten Zelllinien HepG2 und für die Innenseite des Cell-Sheet-Layers die Maus-Fibroblasten Zelllinie L929 bzw. die Endothelzellen der EA.hy926-Zelllinie zur Zellbesiedlung gewählt. Im Verlauf der Zelluntersuchungen zeigte sich, dass die chemische Oberflächenmodifizierung während des Mikrothermoformprozesses Einflüsse auf die kultivierten Zelllinien ausübt. Aus diesem Grund werden alternative Methoden zur Funktionalisierung der Polycarbonat-Folie entwickelt. In diesem Verfahren wird das Substrat erst nach dem Mikrothermoformprozess funktionalisiert, um eventuelle Änderungen der Beschichtungsstoffen beim Erhitzen zu umgehen. Mit dieser Methode werden die besten Zellkultivierungsergebnisse erreicht. Um die Zellkultivierung auf einem Cell-Sheet-Layer-System in einer angepassten Mikro-Umgebung zu ermöglichen, wird ein Zellkultivierungssystem entwickelt, welches die fluidische Umgebung der Zellen berücksichtigt. In diesem System wird eine Trägersubstanz mit humanen Hepatozyten Zellen erfolgreich kultiviert. Insgesamt konnten Cell-Sheet-Layer aus Polycarbonat mit verschiedenen Zelllinien als einfache Zellkultur und als Ko-Kultur kultiviert werden. Diese Methode kann weiterentwickelt werden, um in weiteren Versuchen durch Stapeln der Folien eine dreidimensionale Struktur zu bilden.