Studienabschlussarbeiten

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit einer Anwendung von segmentbasierten Mikrofluidtechnik, bei der etablierten optischen Messtechniken, MTP-Kulturtechniken und moderne molekularbiologische Methoden (NGS, 16S rRNA-Gensequenzen) kombiniert werden, um neue Isolate aus Bodenproben von speziellen Standorten zu gewinnen und zu identifizieren, die in der Lage sind, synthetische wasserlösliche Polymere (Polyvinylpyrrolidon PVP, Polyacrylamid PAM und Polyethylenglykol PEG) und PMMA-Polymerpartikel abzubauen. Zur Bewertung des Bakterienwachstums innerhalb des 500 nl-Segments wurde die Kombination von mikrofluidischen Segmenten mit einem miniaturisiertem Durchfluss-Photo-Fluorimeter verwendet. Es wurden Serien von sub-µl-Segmenten erzeugt, die Bodenbakteriengemeinschaften enthielten und verschiedenen wasserlösliche Polymeren und Polymerpartikel ausgesetzt wurden. Die segmentbasierte mikrofluidische Technik liefert äußerst detaillierte Dosis-Wirkungs-Beziehungen und eignet sich gut für die Umsetzung des Prinzips der "reduzierten Gemeinschaften". Sie ermöglicht die Identifizierung charakteristischer Reaktionsmuster von mikrobiellen Bodengemeinschaften als Reaktion auf verschiedene wasserlösliche Polymere oder Polymerpartikel und die Klassifizierung mikrobieller Gemeinschaften verschiedener Böden. Mit dieser Strategie könnten 84 Isolate aus den Polymer-Experimenten und 20 Isolate aus den PMMA-Polymerpartikel-Experimenten gewonnen werden, wobei die meisten Isolate zu den Phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes gehörten. Anschließende wurden 8 Isolate, darunter Achromobacter spanius, Advenella kashmirensis, Pseudarthrobacter siccitolerans und Priestia aryabhattai ausgewählt, um eine phänotypische Charakterisierung gegen synthetische Polymere mittels Mikrofluidtechnik durchzuführen. Durch hochauflösendes Dosis-Wirkungsscreening konnte gezeigt werden, dass Achromobacter spanius das Potential zum Abbau von PVP, PEG und PAM besitzt. Das Einzelwirkungsscreening der Co-Kultur von Pseudarthrobacter siccitolerans und Priestia aryabhattai gegen PVP zeigte, dass PVP in Co-kultivierten mikrofluidischen Kulturen schneller abgebaut wurde als in Einzelkultur. Das Einzelwirkungsscreening von Pseudarthrobacter siccitolerans gegen PMMA-Partikel zeigte, dass PMMA-Partikel als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden können. Ein Kombinationswirkungsscreening von Advenella kashmirensis gegen binäre Gemische aus PEG und PVP zeigte eine stärkere Autofluoreszenz als beim Screening gegenüber den Einzelsubstanzen.

Ziel der Masterarbeit war die Entwicklung eines mikrofluidischen Systems zur optimierten Synthese von Silber-Nanoprismen. Optimiert werden sollte die Reproduzierbarkeit sowie die Prismenausbeute. Als Basis diente die Batchsynthese nach Aherne 2008, sowie die mikrofluidische Seedsynthese von Thiele 2013. Es stand eine Vielzahl mikrofluidischer Systemkomponenten zur Verfügung, wobei die Aufgabe in der Auswahl und Anordnung sowie der Prozessführung des Systems bestand. Im Verlauf der Masterarbeit wurden mehrere mikrofluidische Systeme getestet, um eine optimale Methode für den Wachstumsschritt der Prismensynthese zu erzielen. Dabei wurden Referenzen synthetisiert, ein Basiskonzept erstellt und die einzelnen Parameter überprüft. Das Synthesekonzept durchlief verschiedene Optimierungsschritte. Zuerst wurde ein einfaches Ein-Mischer-System (4.3 - S. 25) mit zwei Edukteingängen getestet. Ascorbinsäure, Wasser und Seeds wurden in der Versuchsvorbereitung gemischt und über einen Dean-Flow-Mischer mit Silbernitrat versetzt. Das anschließende Wachstum fand im segmentierten Fluss mit Tetradecan statt. Aufgrund der geringen Intensität der Produkte wurde ein zusätzlicher Edukteingang durch einen weiteren Dean-Flow-Mischer angelegt. In dem Zwei-Mischer-System (4.4 - S. 27) wurden die Edukte Ascorbinsäure, Seeds und Silbernitrat über getrennte Spritzen dosiert. Die 5 ml Wasser wurden in der Versuchsvorbereitung auf die Edukte aufgeteilt. Mit diesem System konnte die Intensität der Prismen im UV-Vis Spektrometer gesteigert werden. Jedoch war die Prismenausbeute noch nicht optimal. Daher wurden der Einfluss der Ascorbinsäurekonzentration sowie des Tetradecans auf das Wachstum untersucht. Die Auswertung ergab, dass die Parameter diesbezüglich zufriedenstellend eingestellt waren. Eine Untersuchung der Eduktstabilität ergab, dass durch die Verdünnung der Seeds deren Stabilität beeinträchtigt wurde. Eine Änderung des Versuchsablaufs mit unverdünnten Seeds ergab jedoch nur eine geringfügige Verbesserung. Daher wurde ein neue Systemaufbau geplant. Das nachfolgende System umfasste 4 Mischer (4.5 - S. 36). Jedes Edukt wurde über eine einzelne Spritzen dosiert. Um die großen Volumenstromunterschiede auszugleichen wurde der Wasserstrom durch ein T-Stück aufgeteilt, sodass die Verdünnung in zwei Stufen erfolgte. Neben einem Split&Recombine Mischer, für die Mischung der Ascorbinsäure und Seeds bei geringen Flussraten, wurden drei Dean-Flow-Mischer für die stufenweise Verdünnung und die Mischung mit Silbernitrat verwendet. Das Wachstum fand im segmentierten Fluss mit Tetradecan statt. Über eine Kinetikmessung konnte ermittelt werden, dass nach 3,2 Minuten ˜87 % der maximalen Extinktion erreicht wurden. Das Wachstum war nach 11,2 Minuten vollständig abgeschlossen. Im anschließenden Versuch wurden die Parameter des segmentierten Flusses (SF) hin zu einer stabileren Segmentbildung überarbeitet. Durch Variation der Flussraten wurde eine optimierte Prismenausbeute bei höheren Flussraten festgestellt. Jedoch stand dies im Gegensatz zu einer möglichst langen Verweilzeit und einem stabilen segmentierten Fluss. Als Alternative zum SF wurde eine 96-Well-Platte zur räumlichen Trennung der Reaktionssegmente ohne Tetradecan genutzt. Hierbei ist die Verweilzeit unabhängig vom Produktvolumenstrom und kann beliebig erweitert werden. Um eine Oxidation der Prismen durch Sauerstoff zu minimieren wurde die 96-Well-Platte vor der Synthese mit Argon geflutet und nach der Synthese mit einem Deckel abgedeckt. Es zeigte sich, dass hiermit eine Prismensynthese bei einer hohen Produktflussrate in Kombination mit einer langen Verweilzeit möglich ist. Anschließend wurde der Einfluss der mikrofluidischen Mischer und Verweilschlaufen untersucht. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit wurde die Wasserteilung entfernt. Zudem konnte bei kritischer Hinterfragung ein positiver Einfluss der Eduktverweilschleife nicht festgestellt werden. Im Folgenden wurde auch diese ausgebaut. Das so entstandene Drei-Mischer-System (4.6 - S. 43) stellt das Endkonzept für das Prismenwachstum dar. Es besteht aus einem S&R-Mischer für die Mischung der Ascorbinsäure mit den Seeds. Anschließend erfolgt eine Verdünnung mit Wasser und daraufhin die Zugabe von Silbernitrat in jeweils einem DF-Mischer. Das Wachstum findet in einer mit Argon gefluteten 96-Well-Platte statt. Die letzten zwei Versuchsreihen dienten der Überprüfung der Reproduzierbarkeit sowie der Größeneinstellbarkeit. Es wurde die Prismenausbeute und die Größenverteilung ermittelt. Die Übereinstimmung zweier Proben bei identischen Syntheseparametern konnte durch die mikrofluidische Synthese sichtbar verbessert werden. Die rechnerische Auswertung der Halbwertsbreite ergab eine deutliche Optimierung der Größenverteilung, sodass die Peakbreite jeder mikrofluidischen Probe geringer ausfiel als die Peakbreite der optimierten (computergesteuerten) Batchproben. Der Vergleich mit weiteren, normalen Batchreferenzen bestätigte dies, wobei die Unterschiede noch deutlicher ausfielen. Kritisch betrachtet ist das wichtigste Maß der Synthesequalität die Prismenausbeute. Bei einem Seedvolumen von 120 [my]l konnte nur eine kleinere Verbesserung der mikrofluidischen Prismenausbeute ([my] = Ø 36 % gegenüber b = Ø 33 %) festgestellt werden. Bei einem Seedvolumen von 60 [my]l beträgt die mikrofluidische Prismenausbeute 64 % und zeigt somit eine deutlichere Verbesserung gegenüber der Batchreferenzsynthese mit 51 %. Prismenausbeute.

Diese Masterarbeit befasst sich mit der Synthese von Polymerpartikeln mit einer möglichst großen Oberfläche unter Verwendung einer tropfenbasierten Mikrofluidtechnik. Darüber hinaus wird die Änderung des Zeta-Potentials der Polymerpartikel durch ionische Monomere und polyionische Makromoleküle sowie die Assemblierung der Polymerpartikel mit Metallnanopartikeln durch elektrostatische Wechselwirkungen untersucht. Von diesen Komposit-Partikeln wird erwartet, dass sie eine Signalverstärkung für die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) erzielen können. Die Polymerpartikel wurden in einem Mehrphasensystem synthetisiert. In der organischen Phase wurden Monomere - Divinylbenzol(DVB) oder Methacrylsäuremethylester(MMA), thermische Initiatoren - Azobis(isobutyronitril) AIBN oder Kaliumperoxodisulfat (KPS) in Toluol zugegeben. In der wässrigen Phase wurden verschiedene Tenside wie Span20, Brij52, SDS oder Polyelektrolyte wie Natrium-Polystyrensulfonat (PSS), Polydiallyldimethylammoniumchlorid (PolyDADMAC) eingesetzt. Es konnte festgestellt werden, dass die Morphologie und die Größe der Oberfläche der Polymerpartikel von vielen Parametern, wie unterschiedlichen Tenside, Durchflussratenverhältnissen der wässrigen Phase und organischen Phase, Massenverhältnissen innerhalb der organischen Phase sowie Reaktionstemperatur und zeit, beeinflusst werden. Mit der Zugabe der polyionischen Makromoleküle PolyDADMAC oder PSS kann das Zeta-Potential der Partikel gezielt geändert werden. Zusammen mit der vergrößerten Oberfläche eignen sich die Polymerpartikel dazu, Metallnanopartikel durch elektrostatische Wechselwirkungen anzulagern.

Ziel der Bachelorarbeit war es eine möglichst universell anwendbare Methode zur Qualitätskontrolle von Antikörpern und auf antikörperbasierenden Produkten, insbesondere perxodasemarkierte Antikörper, mittels HPLC-gekoppelter Größenausschlusschromatographie zu entwickeln. Hierzu wurden zunächst allgemeine Versuchsparameter, wie z.B. Laufpufferzusammensetzung und Flussgeschwindigkeit, untersucht. Anwendung fand die entwickelte Methode letzten Endes bei der Überprüfung, ob die Peroxidasemarkierung eines a-MRP14 Antikörpers vollständig abgelaufen ist, was durch Spiken einer Lösung, welche peroxidasemarkierte Antikörper enthält, mit unmarkiertem Antikörper simuliert wurde. Hier zeigt sich ein durchaus geeignetes Anwendungsgebiet der Methode, was sich anhand der geringen nachweisbaren Mengen von unmarkiertem Antikörper zeigen lässt. Ein weiteres Anwendungsgebiet war die Untersuchung der Stabilität von FP72 Antikörpern in unterschiedlichen Matrizes, wobei, aller Wahrscheinlichkeit nach, aufgrund der bereits stark aggregierten Antikörper Ergebnisse erzielt wurden, welche gängigen Theorien, zumindest zum Teil, widersprechen.